198514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek renaturálására
1 2 EDTA ♦ 0,5 mól/1 L-ar ginin + 0,3 mmól/1 GSSG + ♦ 1,5 ínmól/1 GSH. — Reak ti válási puffer a redukált protein hozzáadása után: 0,1 mól A 10,4 pH-jú TR1S/HQ ♦ 1 mmólA EDTA + 0,33 mólA L-argínln * 0,2 mmólA GSSG ♦ * 1 mmólA GSH. Adagonként koncentráció-növekedés 18-27 Mg/ml Végkoncentráció 15 adag után: 227 Mg/ml Az aktivitásmérés (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva) 24 ór.ás 20 °C-on végzett reoxidálás után történik. Az eredményeket a 2. táblázat mutatja: 2. táblázat rec-tPA ,,adagolásos-reaktlválása,' Adagolási sebesség (perc) Kitermelés (%) Stimulálhatóság (faktor) 2 31,3 7,1 T0 38,6 8,1 20 39,5 9,0 30 44,8 8,2 45_______________ 45.8 _____________UL 1) A 7. ábrának megfelelő maximális reakti válásra vonatkoztatva. Magyarázat:- Az alkalmazott kiindulási anyag esetében a reaktiválási kitermelés — a bevitt proteinmennyiségre vonatkoztatva - 20 Mg/ml-n él nagyobb koncentrációknál csökken (7. ábra). A CNBr/FSP-vel való stimulálhatóság a mérés pontosságán belül a reaktiválási koncentrációtól függetlennek bizonyul (1. táblázat).- A reaktiválás felezési ideje 20 °C-on az adott kísérleti körülmények között 7±2 óra.- a reaktiválási kitermelés a reaktiválási adagok közötti várakozási idő hosszabbodásával nő (2. táblázat). ■ 4. példa Antitestek adagolásos renaturálása A proteinoldat előkészítése: A humán kretinkináz vád zömöt tzoenzime (CK-MM) elleni monoklonális antitesteket (MÁK 33) az ECACC... hibridoma sejtvonalból nyerünk [lásd P. Buckel és munkatársai, Gene 51, 13-19 (1987)]. Ebből a preparátumból A. Johnstone és R. Thorpe [ImmunochemisUj in Practice, L’ackwell Scientific Publications (1982), 52-53. old.] szerint Fab-fragmenseket izolálu k Az aktív immunreaktivitás kimutatása: Aktív ímmunreaktivitáson itt a natív, illetve renaturált Fab-F ^gm^nsnek a specifikus antigénné (jelen esetben humán-CK MM-rnel) való reakcióját értjük. Egy Ei ~ V-tesztrendszerben mérjük ezt a reakciót enzim-konjugált poliklonális an ti-egér-antitestek segítségével kvantitatíve az ABTS kromogén szubsztrát átalakítása útján kolorimetrikusan (H. U. Bergmeyer, Methods in Enzymatic Analyisis, 3. kiadás, IX. kötet, 15-37. old.). Redukdó/denaturálás: 5 mg MÁK 33 FAb-ot 3 óra hosszat inkubálunk 25 °C-on 1 ml elegyben, melynek összetétele: 0,1 mólAiter . 8,5 pH-jú tris. HO ♦ 6 mólAiter guanidin . HO + 0,3 mólAiter ditioeritritol (DTE) + 2 mmólAiter etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA). Ütána a pH-t 3-ra állítjuk, és 2 pH-jú 6 mólAiter koncentrációjú guanidin . HO oldattal szemben dializáljuk. Renaturálás/reoxidádó: Reoxidádó 20 °C-on a denaturált proteinoldatnak a következő végkoncentrádóra való hígításával: 0,1 mólA STS pH-jú tris.HQ + 0,3 mól A guanidin . HG ♦ 2 mmól/1 EDTA + 0,2 mmólA oxidált glutation (GSSG) + 2 mmólA redukált glutation (GSH). Redukált MÁK 33 Fab adagolásos renaturálása”: t= 24 órás időközönként 5 x 20 pd-t adunk redukált MAK33 FAB 6 mólA koncentráaójú 2 pH-jú guanidin . HQ oldattal készített oldatából a renaturáló oldathoz. Adagonkénti koncentrádónövekedés: 0,02—0,021 mg/ml. 5 adag utáni végkoncentrádó: 0,103 mg/ml. összehasonlító renaturálás adagolás nélkül: Egyszeri beadagolás azonos végkoncentrádóig. A pufferkörülmények hígítás után az előbb megadott reoxidáló puffemek felelnek meg. A denaturált protein hozzáadásának befejezése után1 200 óra renaturálás 20 °C-on. Végül a kitermelés meghatározása az aktív immunreaktivitásnak az eredetileg beadagolt natív Fab-hoz viszonyított mérésével: Adagolásos renaturálás: 8% Adagolás nélküli összehasonlító mérés: 7%. A jelen találmány szerinti „adagolásos renaturálással” az adagolás nélküli renaturáláshoz képest 11 -szer magasabb kitermelés érhető el. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás denaturált proteinek renaturálására oldatban valamilyen renaturáló pufferban, azzal jellemezve, hogy a kiválasztott 6-10,5 pH-jú pufferben elkészítjük a renaturálandó protein kritikus koncéntrádójú oldatát, és a hajtogatott intermedier keletkezése után további renaturálandó proteint adunk hozzá a kritikus koncentrádó eléréséhez szükséges mennyiségben. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást szakaszosan hajtjuk végre, amennyiben minden alkalommal a hajtogatott intermedier képzéséhez szükséges idő lefutása után pótoljuk a kritikus koncentrádó eléréséhez szükséges mennyiségű denaturált proteint. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást folyamatosan hajtjuk végre olymódon, hogy a folyamatos renaturáláshoz egy reaktorba folyamatosan adagoljuk a kritikus kocentráaó eléréséhez szükséges mennyiségű denaturált proteint és a megfelelő mennyiségű renaturáló puffert, és az elegy reaktorban való tartózkodásának idejét a hajtogatott intermedier képződéséhez szükséges időtartamra szabályozzuk bés 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a denaturált proteint addig adagoljuk a reaktorba, amíg a renaturált protein optimális koncentrádója beáll, és utána az így kapott oldatot folyamatosan eltávolítjuk, és denaturált protein opti-198.514 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
