198514. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinek renaturálására
1 2 A-rész — 'Gélszűrés Sephadex G25F-en (oszloptérfogat « * 270 ml), 0,01 mólos sósav-oldatban. — A csúcsfrakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Brész — Dialízis háromszor 1 1 0,01 mólos sósav-oldattal szemben 4 °C-on, — Liofilizálás. Mindkét sómentesítési eljárás (A- és B-rész) olyan redukált lizozimot eredményez, amelyek a reaktiválási tulajdonságok vonatkozásában nem különböznek. — A liofilizált redukált enzimet -40 °C-on nitrogéngáz alatt tároljuk. Reoxidádó/reaktiválás: — 12 mg redukált lizozimot oldunk 1 ml 0,01 mólos sósav-oldatban. — Szűrés Millipore-on. — Koncentráció-meghatározás UV-abszorpdóval. — Reoxidádó 25 °C-on 0,1 mól/1 8,2 pH-jú TRlS*Hd ♦ 1 mmól/1 EDTA * 3 mmól/1 GSH (redukált glutation) ♦ 0,3 mmól/1 GSSG (oxidált glutation) eleggyel való hígítással. b) A renaturálás kritikus koncentrádójának meghatározása — A redukaó/reoxidádó a fentebb leírtak szerint történik változó protein-koncentrádóval a reaktiválási elegyben. Az eredményt az 1. ábra mutatja, ahol a redukált lizozim 20 óra 25 °C-on való reoxidálása utáni reaktiválásának koncentrádófüggését ábrázoljuk grafikusan. c) A hajtogatott intermedier képződéséig eltelő idő — Az előbb leírtak szerint redukdóval/reoxidádóvai 25 °C-on 0,03 mg/ml protein-koncentrádónál meghatározzuk a redukált lizozim reaktiválásának kinetikáját. Az eredményt a 2. ábrán grafikusan ábrázoljuk. d) Redukált lizozim ,,adagolásos reaktiválása" — 1,6, illetve 2,4 ml 0.125 mól/1, 8,2 pH-jú TR1S/ /HO ♦ 1,25 mmól/1 EDTA + 3,75 mmól/1 GSH * 0,375 mmólfl GSSG elegyet készítünk elő. ■ 1. Kísérlet — 10 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 20 #d redukált lizozimot adunk az elegyhez. Koncentrádó-növekedés adagonként: 0,11-0,13 mg/ml. Végkoncentrádó 20 adag után: 2,15 mg/ml. — összehasonlító reaktiválás adagolás nélkül: Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig. A , pufferkörülmények hígítás után az előbb leírt reoxidádós puffemak felelnek meg. — 25 °C-on való 2 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva): Adagolás reaktiválás: 2200 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 470 lU/mg 2. Kísérlet — 10 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 30 redukált lizozimot adunk az elegyhez 0,01 mólos sósav-oldatban oldva. Konoentjádó-növekedés adagonként: 0,034— —0,042 mg/mf. Végkoncentrádó 20 adag után: 0,68 mg/ml. — összehasonlító aktiválás: Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig. — 25 °C-on 0,5 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva): Adagolás reaktiválás: 7600 lU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: , 1400 IU/mg. 3. Kísérlet — 20 perces időközönként 20 alkalommal egyenként 20 jd redukált lizozimot adunk az elegyhez 0,01 mólos sósavban oldva. Koncentrádó-növekedés adagonként: 0,035— —0,044 mg/ml Végkoncentrádó 20 adag után: 0,71 mg/ml. — összehasonlító reaktiválás: Egyszeri hozzáadás azonos végkoncentrádóig, — 25 °C-on 24 óra reaktiválás után (a denaturált protein hozzáadásának a végétől számítva): Adagolás reaktiválás: 10100 IU/mg összehasonlítás adagolás nélkül: 1400 IU/mg Ezekből az eredményekből az adódik, hogy: — A reaktiválási kitermelés 0,1 mg/ml-nél nagyobb protein-koncentrádóknál folyamatosan csökken. — a megadott reoxidálási körülmények között a reaktiválás 25 °C-on 15 perc múlva csaknem tökéletesen befejeződik (2. ábra). — A találmány szerinti .adagolásos reaktiválás”-sal az adagolás nélküli reakti váláshoz képest 5—7-szer magasabb kitermelés érhető el. 2. példa LDH-M4 „adagolásos reaktiválása” a) Az enzim-oldat előkészítése: — Sertésizomból származó LDH-M4 (laktát-dehidrogenáz) ammónium-szulfátos szuszpenziót (gyártó: Boehringer Mannheim GmbH, cikkszám: 107077) centrifugálunk, és az üledéket az eredeti térfogat 1/6-ának megfelelő térfogatú 0,1 mól/1 7,6 pH-jú kálium-foszfát ♦ 1 mmól/1 EDTA + 1 mmól/1 DTE eleggyel oldjuk, — és kétszer 1 1 azonos pufferral szemben 4 °C-on dializáljuk. — Koncentrádó-meghatározás A= 14 felett. (A= = l^os oldat abszorpdója 280 nm-nél). — a 25 °C-on R. Hermann, R. Jaenicke és R. Rudolph [Biochemistry 20, 5195-5201. (1981)] szerint végzett aktivitás-vizsgálat alapján a fajlagos aktivitás^ 300 IU/mg. Denaturálás/reaktiválás. — Denaturál ás: 1:5 hígítás 0,1 mólos foszforsav-oldattal, 6 perc inkubálás 0 °C-on. — Reaktiválás: 1:3 hígítás 0,1 mól/1 12,65 pH-jú kálium-foszfát + 1 mmól/1 EDTA + 1 mmól/1 DTE eleggyel 20 °C-on, elegyítés után az oldat pH-ja 7,6. b) A renaturálás kritikus koncentrádójának meghatározása — Denaturálás/reaktiválás az előbb leírtak szerint történik a protein-koncentrádónak a denaturáló elegyben való változtatása közben. A 3. ábra LDH-M4 savas denaturálás utáni reaktiválásának koncentrádó-függését mutatja, ahol a 25 °C-on 20 óra reaktiválás után mért aktivitást a koncentrádó függvényében ábrázoljuk. 198.514 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
