198461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiadiazol származékok és az azokat vagy analógjaikat hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 198461 B 2 influenza-vírussal szembeszálló in vivo aktivitása különösen jól jellemzett. Az in vivo tesztkísérletek során 18 darab CD-I egérből álló csoportokat kivizsgáltunk A-Ann Arbor influenza-tenyészet előre meghatározott mennyiségeivel való fertőzés után. A tiadiazolt szintén meghatározott dózisban kapták az állatok, és kontrollként a csak hordozóanyagot kapott csoport szolgált. A teszt 10 napig tartott. Az egyes csoportokban az egyes napokon elpusztult állatok számát követtük nyomon. A 10. nap végét is megérő állatot tekintettük túlélőnek. Az adatok elemzésére a "túlélési index” módszert alkalmaztuk, a következőképpen: A kontrollcsoport adataiból minden naphoz (X) egy "túlélési index” értéket (TIxnap) rendeltünk attól a naptól kezdve, amikor a kontrollcsoportban az első haláleset történt (általában az X = 4. napon) egészen a 10. napig. Az első haláleset napján a "túlélési index” érték definíció szerint nullával egyenlő. A többi napra vonatkozó értékeket a következő képlet segítségével számíthatjuk: TlXjup = (X-l) Az X.nnpon clmiszmlt kontroll .Hlmok szdiua kontroll állatok teljes száma + TI(X-l). nap. Például, ha az az első nap, melyen egy kontroll állat elpusztul éppen X = 4. nap, és az 5. napon a 18 kontroll állatból további 3 pusztul el, akkor, mivel TU.nap = nulla, TlS.nap = (5-1) — + 0 = -Jtt 0,66 lo lo A túlélők részére szolgáló "T.I. túlélők” index szintén a kontroll csoport adatai alapján számolható ki a következő képlet segítségével: TItdIáldk = 10 X A 10. nanon elpusztult kontroll állatok száma Kontroll állatok teljes száma + Tito nap Az így számított indexek használhatók azután az átlagos túlélési értékek megállapítására mind a kontroll csoport, mind a vizsgált állatok csoportjai esetén a következő eljárás alkalmazásával: A kontroll csoport átlagos túlélési indexe, "TIkomroll” úgy számítható ki, hogy minden egyes TIxnap értéket megszorozzuk az azon a napon elpusztult kontroll állatok számával, a TItúiélők értéket pedig megszorozzuk a túlélők számával, ha vannak, ezen szorzatokat összegezzük és osztjuk a kontroll állatok teljes számával. A kezelt csoportra egy átlagos túlélési érték (’Tlkezcli”) úgy számítható ki, hogy minden egyes TIxnap értéket megszorozzuk az azon a napon elpusztult kezelt állatok számával, a Tltúldlők értékét pedig megszorozzuk a túlélő kezelt állatok számával, ezeket az értékeket összegezzük és osztjuk a kezelt állatok teljes számával. A következő képlet alapján, ahol P jelentése: a maximum %-a, a kontroll csoport eredményeivel való összevetés számítható x 100 Titulálok “ TI kontroll Ha az átlagos túlélési érték a kezelt állatokra kisebb, vagy egyenlő a kontroll állatok átlagos túlélési énékével, akkor ennek a képletnek az alapján P = 0 %. Ha az átlagos túlélési érték a kezelt állatokra egyenlő a túlélők túlélési indexével, akkor P = 100 %. Ezt a P értéket azután egy un. relatív aktivitás indexhez (RA) rendeljük a következő módon: p RA 20 % vagy kisebb = 1 (küszöbérték) 20-40% 2 (kicsit aktív) 40 - 60 % 3 (közepesen aktív) 60 - 80 % 4 (jó aktivitás) 80 - 100 % 5 (nagyon aktív) Az I. táblázat a találmány reprezentatív vegyületeinek RA énékeit mutatja: I. TÁBLÁZAT (IV) képletű vegyületek R5 R3 RA-S-CH2CH3 H 5-S-CH3 H 5-S-CH2CH2CH2CH3 H 5-S-CH2=CN H 2,5-S-CH2-2-piridil H 2.5 A szöveti sejtkultúrák rendszerében in vitro a vírussokszorozódás gátlásának kvantitatív meghatározására alkalmas módszerek a plekk-csökkenlő vizsgálatok. Ebben a tesztben az érzékenyített MDCK sejteket 25 cm3-s Falcon-edényekben növesztettük 37’C-n Medium 199-ben 5 % inaktivált magzati ökörszérum (FBS), penicillin (300 egység/ml) és sztreptomicin (300 pg/ml) jelenlétében. Az összefüggő egyrétegű borítottság kialakulása után a táptalajt eltávolítottuk és 0,3 ml megfelelően hígított vírust adtunk minden egyes palackhoz. 1 órás szobahőmérsékleten történő adszorpció után a fertőzött sejtréteget lefedtük egyenlő részletekben 1 %-os agarózzal és 2x Medium 199-al, 2,5 % FBS-sel, penicillinnel és sztreptomicinnel, a tesztelt vegyületek különböző koncentrációit az agar borításba beágyazva. A vegyületeket dimetil-szulfoxidban (DMSO) oldottuk fel 10,000 pg/ml koncentrációban, majd egy alikvot mennyiséget hígítottunk a kívánt koncentrációban az agar segítségével. A palackokat addig inkubáltuk, amíg a kontroll edények optimális plckkméretet (2-10 mm) nem mutattak. 10 % fomialint és 2 % nátrium-acetátot tartalmazó oldatot adtunk minden palackhoz, hogy a vírust inaktíváljuk és a sejtréteget a műanyag felülethez kössük. A plekkokat a környező sejtterületek kristály-ibolyával történő megfestése után számoltuk meg. Az egyes koncentrációknál a duplikál palackokra nyert eredményeket átlagoltuk és összehasonlítottuk a kontroll palackkal. A plakk-képződés gátlását 50 %-nál (I50) a 10- 90 %-s gátláshoz tartozó eredmények felrajzolásával becsültük meg. Három influenza-törzsnél kapott eredményeinket mutatja be a III. táblázat. In vitro használat esetén a vegyületeket a szövetkultúrához adjuk a vírusnövekedés visszaszorítása céljából. A vegyületek előnyös alkalmazása történhet in vivo, mikoris parenterálisan, helyileg, szájon át, vagy inhalálás útján orron keresztül visszük be a vegyületeket a vírusfertőzéstől szenvedő vagy arra érzékeny 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
