198293. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált piperazinil-1,4-naftalin-dion származékok és hatóanyagként e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 oldunk, és az oldat végtérfogatát 2 1-re állítjuk be. Humán albumin oldat 30 mg/ml koncentráció (Sigma Chemical Co.). •* Kalcium- és magnézium-törzsoldatok Kaldum-klorid-dihidrátból és magnézium-kloridból 0,075 mól/1, illetve 0,5 mól/1 töménységű oldatokat készítünk. Tris-A-puffer 10 ml 10 x Tris-puffert és 1,0 ml humán albumint 100 ml-re hígítunk vízzel. Tris-ACM-puffer 10 ml 10 x Tris-puffert, 1 ml humán albumint, 0,8 ml kaldum-törzsoldatot és 0,2 ml magnézium-törzsoldatot 100 ml-re hígítunk vízzel. Nyúl antihumán IgE A fenti készítményt általában 10 /rg protein/ml végkoncentrádóban alkalmazzuk (Boehring Diagnostics). Házipor-atka-extraktum (Dermatophagoides Farinae) 1:100 (tömeg/térfogat) erősségű allergén extraktum (Hollister-Stier Labs ). Ezt általában 1:1000 és 1.10000 közötti hígításban használjuk (törzsoldatnak az üvegcsében lévő oldatot tekintjük). Egyéb allergének lntradermáüs oldatok vagy intramuszkuláris készítmények, hiposzenzitizálásra (Hollister-Stier Labs.) A készítményeket 1 PNU/ml nagyságrendű végkoncentrádóban használjuk. Leukodták elválasztása emberi vérből, és provokál ás Anti-lgE-re, parlagfű-antigénre vagy más spedfikus allergénre tudottan hisztamin -felszabadulással reagáló egyedektől 80 ml vérmintát veszünk, 20 ml-es heparinozott kémcsövekbe. A fenti 80 ml vért 20 ml sóoldattal keveijük, amely 0,6 g dextrózt és 1,2 g dextránt tartalmaz A vért két 50 ml-es polikarbonát centrifugacsőben hagyjuk szobahőmérsékleten ülepedni, míg a vörös vérsejtek és a plazma között éles határvonal keletkezik (közel 60-90 perc). A felső plazma-réteget pipetta segítségével mindkét csőből leszívjuk, és két másik 50 ml-es polikarbonát centrifugacsőbe visszük át. A plazmát 100 x g-vel 4 °C-on 8 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszót óvatosan ieöntjük, amennyire csak lehetséges, és a sejtmaradékot szilikonozott Pasteur-pipetta segítségével 2—3 ml Tris-A-pufferben újraszuszpendáljuk. Az újraszuszpendálás céljából a folyadékot a pipettába óvatosan felszívjuk és kiengedjük, a pipetta hegyét a folyadékfelszín alatt tartva, míg egyenletes sejtszuszpenziót kapunk. A szuszpenzió végtérfogatát ezután Tris-A-pufferrel 45 ml-re állítjuk és a cső tartalmát 110 x g-vel 8 percen keresztül 4 °C-on centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük és a sejtmaradékot a fenti módon újraszuszpendáljuk és újracentrifugáljuk. A felülúszót leöntjük, a sejtmaradékot 2—3 Tris- ACM-pufferben újraszuszpendáljuk, ily módon megfelelő nagyságú végtérfogatot kapunk ahhoz, hogy a reakdóedénybe adagolhassuk a készítményt. Az anti-lgE-t vagy antigéneket, és adott esetben a vizsgálandó vegyületet 0,2 ml végtérfogatban tartalmazó kémcsöveket 37 °C-os fürdőbe helyezzük. A sejteket 37 °C-on tartjuk, és gyakran kavargatjuk, hogy egyenletes szuszpenziót biztosítsunk, miközben minden egyes kémcsőbe 1,0 ml aliquotot adagolunk. A csöveket ezután 37 °C-on 60 percen át inkubáljuk, miközben a csöveket 15 percenként óvatosan megkeverjük, az egyenletes sejtszuszpenzió biztosításira. A reakdó befejeztével a csöveket 4 °C-on 10 percen át centrifugáljuk 1500 fordulat/perc sebességgel, a sejtek ülepítése céljából. A felülúszóból 1 ml alikvotokat 12 mm x 75 mm-es polietilén csövekbe visszük át és minden egyes csőbe 0,2 ml 8%-os perklórsavat mérünk- Minden egyes vizsgálatban vakpróbát és össz-hisztamint is használunk. A vakpróba tartalmazza a sejteket és minden egyes reagenst, az antigén vagy antí-lgE kivételével. Az össz-hisztamin 0,24 ml 8%-os perkíórsavat, 1 ml sejtet és 0,2 ml puffert tartalmaz. Minden egyes mintát ezután centrifugálunk, a kicsapódott protein eltávolítására. A felszabadult hisztamin mérése automatizált fluorometriás eljárással A fenti automatizált eljárást Sraganian R. P [Anal. Biochem. 57, 383 (1974), és J. Immunoi. Methods 7, 283 (1975)] módszere szerint végezzük, amely Shora P. A. és munkatársai [J. Pharmacol. Exp. Ther. 217, 182 (1959)] manuális eljárásán ala: pul. Az automatizált rendszer az alábbi Technicon Autoanalyzer II összetevőkből .áll: mintaadagoló (Sampler IV), kétsebességű elosztó szivattyú (Dual- Speed Proportioning Pump III), keskeny áteresztésű első szűrővel (7- 60) és második szűrővel (3-74) ellátott fluoronefelométer, regisztráló szerkezet, digitális kiíró. A Siraganian fent idézett cikkében ismertetett elosztóvezetéket használjuk, azzal az eltéréssel, hogy a dializálót elhagyjuk, az összes szivattyúvezeték egy nagy kapacitású egyszerű elosztószivattyún megy keresztül, és kétszeres mintatérfogatból végezzük az analízist. Az automatizált műveletsorozat a következő lépésekből áll: extrakdó lúgos sóoldatból butanolba, vissza-extrahálás híg sósavoldatba heptán hozzáadásával, hisztamin reagáltatása o-ftáldialdehiddel (OPT) magas pH-n, és az OTP-adduktum átalakítása stabil fluoroforrá foszforsav segítségével. A reakcióterméket ezután átvezetjük a fluorométeren. A teljes skála-kitérést 50 mg hisztamin-bázissal közel 0,5 ng küszöbérzékenységre állítjuk be. Hisztamin-felszabadulási vizsgálat eredményeinek kiszámítása Az egyes minták hisztamin-értékéből (ng) levonjuk a vakpróba (mosófolyadék) értéket. Ezután az egyes minták ng hisztaminértékét osztjuk a három össz-hisztamin érték átlagával (perklórsawal lizált sejtek), az eredményt százzal szorozva kapjuk a %-os felszabadulást. A kontroll minták antigént tartalmaznak, de vizsgálandó vegyületet nem. A vakpróbák (vagy spontán felszabadulás minták) sem antigént, sem viszgálandó vegyületet nem tartalmaznak. A vakpróbák átlagértékét (három párhuzamos mérésből) levonjuk a kontrollokra és vizsgálandó vegyületekre kapott %-os felszabadulásból. Kiszámítjuk a kontroll csoportok és a vizsgálandó vegyületet tartalmazó csoportok átlagértékeit és a 198.293 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
