198264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antitrombotikus gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 A találmány parenterális, különösen trombózisos megbetegedések kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményekre és azok előállítására vonatkozik. A humán szöveti plazminogén aktivátor (a továbbiakban tPA) kb. 70.000 dalton mólsúlyú és 527 antinos3vat tartalmazó glukoprotein, amely különböző humán szövetekből választható ki és jelen van a szérumban is. A tPA-nak vérrög-eloszlató hatása van azáltal, hogy a plazminogént plazminná alakítja, affinitása van a fibrinhez és annak jelenlétében sokkal aktívabb- Uy módon a tPa alkalmas trombusképződéssel járó betegségek, így például mélyvénás trombózis, akut myokardiális infarktus és piümonáris embólia kezelésére (lásd például Rijken és mtásai, Biochem. Biopbys, Acta 580:140 /1979/, Vetterlein és mtársai, J. Bioi. Chctn. 254:575 /1989/. Rijken és mtársai, J. Bioi. Chem. 256:7035 /198/ és Matsuo és mtársai. Nature 291:590 /1981 /). A tPA termelését bizonyos sejtvonalak, így például a Bowes melanoma sejtvonal végzi (Wilson és mtársai, Cane, Rés., 40, /1980/, 933). Collen és mtársai ismertetik a Bowes mclanomá-ból kinyert tPA tisztítását (A 41 766 számú európai bejelentés) és Wilson és mtársai a szérum-független Bowes melanoma sejtvonal alkalmazásával végzett tPA előállítást és tisztítást írják le(A 113 319. számú európai szabadalmi leírás). A tPA-t rekombináns DNS technikával is elő lehet állítani. tPA-ra klónozott mRNS izolálását ismertetik Opdenakker cs mtársai (Eur. J. Biochem., 121, /1982/, 269), a tPA-ra klónozott cDNS izolálását Edlund és mtársai (proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, /1983/, 349), a cDNS klónozását E. coli-ban Pennica és mtársai (Nature, 301, /1983/, 214) és a cDNA klónozását E. coli ban és Chinese Hamster Ovary sejtben Goeddel és mtársai (A -93 619. számú európai szabadalmi bejelentés) és Levinson és mtársai (A-l 17 059. számú európai szabadalmi bejelentés) ismertetik. Brouty-Boye a tPA humán embrionális tüdő-sejtben való tPA képződést írják le (Bio-Technology, December, 1984, 1058). Robinson olyan módosított tPA-t ismertet, amelyben részben vagy teljesen hiányzik a natív tPA-ban jelenlevő szénhidrát-rész. (W084-01786. számú PCT közzétételi irat). A tPA vízben igen kevéssé oldódó anyag, oldhatósága pH= 7-nél csupán 0,1 mg/ml. Ily módon a tPA tisztítása során általában szolubilizáló szereket alkalmaznak, mint például kaotropikus denaturáló szereket, például karbamidot vagy tiocianátot, továbbá felületaktív anyagokat, például detergenseket, szénhidrátokat, például mannitot, továbbá fehérjéket, például abumint vagy zselatint. Bár ezek a szerek növelik a tPA vízben való oldhatóságát, a kapott oldat instabil és nem alkalmas parenterális adagolásra vagy károsan nagy mennyiségben kell alkalmazni. Wilson (A-l 13 319. számú európai szabadalmi leírás) javaslata szerint nemionos detergenst adagolnak a stabilitás fokozására és a burkolóanyag (container) felületén való adszorpció megakadályozására. Egy Wilson által leírt készítmény összetétele a következő: 0,075 mgfml tPA, 0,3 mólos nátrium-kloridban és 0,01% Tween®80-ban. Goeddel és mtársai (A-93619 számú európai szabadalmi leírás) szerint a tPA-t standard eljárások szerint lehet formulázni és egy 25 000 nemzetközi egység tPA-t, 25 mg mannitot és 5 ml vízzel elkevert 45 mg nátrium-ldoridot tartalmazó 0,9%-os nátrium-klorid oldattal elkevert készítményt ír le. Collen és mtársai (A- 41.766 számú európai szabadalmi leírás) szintén azt mondják, hogy a tPA standard eljárásokkal formulázható adalékok nélkül, vagy glukóz, mannit vagy albumin adalék jelenlétében és egy 0,001% Tween®80-at és 0,01—1% albumint vagy mannitot, foszfáttal pufferolt sóoldatban tPA-t tartalmazó készítményt írnak le. Yoshizaki és mtársai (112.940. számú európai szabadalmi leírás) tPA készítmények esetében az albumin alkalmazását Murakami és mtársai pedig a tPA zselatinnal való stabilizálását ismertetik. Kruithof és mtársai (Biochem. J. 226, /1985/, 631-636) egy szérum-független Bowes melanoma sejtből nyert tPA tisztítási eljárást ismertetnek, amely a következő lépésekből áll: a közeg centrifugálása, Tween®80 és Na3N adagolása felülúszóhoz, a pH beállítása 6 mólos sósavval 4,5-ös értékre, SP-Sephadex -töltetű oszlopon való átengedés és a tPA eluálása nátrium-acetáttal pufferolt nátrium-kloriddal (0A mólos nátrium-acetát, 0,25 mólos 0,01% Tween®80, 0,05% Na_, N), majd a kapott eluátumok sóösszegyűjtése, betöményítése 0,93 mg/ml tPA koncentrációra (42.800 egység/ml), ismételt tisztítás Sephadex®G- 100 töltetű oszlopon a fenti eluenssel, majd a kapott termék betöményítése 0,38 mg/ml tPA koncentrációra (35.000 egység/ml). A tárolás hőmérséklete —70 °C. Az American Diagnostics, Inc. liofilizált tPA készítményt hoz forgalomba, amelyet a felhasználáshoz 0,1 mólos ecetsav/nátrium-acetát puffénál 3,9 pll-n kell elkeverni, szükség esetén a pH-t növelni és adott esetben a kiválás megakadályozására 1 mg/ml mennyiségben albumint adagolni. A találmány célja tPA-t tartalmazó steril, különösen parenterális adagolásra alkalmas gyógyszerkészítmény előállítása, amely nem tartalmaz tipikus szolubilizáló/stabilizáló szereket, így például kaotropikus szereket, felületaktív anyagot, fehérjeszerű anyagokat, szénhidrátot az oldhatóság növelésére és az oldhatósága vízben nagyobb, mint 0,1 mg/ml, és szobahőmérsékleten viszonylag stabil. A fentiek alapján találmányunk tárgya steril, elsősorban parenterális adagolásra alkalmas tPA-t tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítása, amely a tPA-t gyógyszerészetileg elfogadható, 3,5—5,5 pH értékű pufferolt oldatban tartalmazza. A találmány szerinti eljárás egy előnyös megvalósítási formájánál olyan gyógyászati hatású kompozíciót ( a továbbiakban kitt) állítunk elő, amely egy vagy több steril, a tPA-t liofilizált formában tartalmazó elemet (a továbbiakban tartályt) és egy vagy több, a felhasználáshoz szükséges oldatot tartalmazó steril elemet (a továbbiakban tartályt) tartalmaz, amelyben a puffert az egyik vagy mindegyik tartály tartalmazza, és amelyben a felhasználáshoz szükséges oldat, a puffer, valamint ezek és a tPA mennyisége úgy van megválasztva, hogy a tartályok egyesítésekor olyan parenterális adagolásra alkalmas egység' dózist nyerjünk, amely 0,1-15 mg/ml tPA-t tartalmaz gyógyászatiig elfogadható pufferolt oldószerben, 3,5—5,5 pH-tartományban. Az 1. ábrán grafikusan mutatjuk be a tPA kezdeti degradádóiának mértékét (aktivitásának csökkenését) 0,39 mg/ml koncentrációjú karbamid vagy 198.264 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
