198215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a TAN-749 antibiotikummal rokon szerkezetű vegyületek előállítására
11 HU 198215 B 12 -lisztet, 0,3% kukoricalekvórt, 0,5% Polypeptont (Dalgo Nutritive Chemical, Japán) és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz (pH 7,0) 0,5% precipitált kalcium-karbonátot adunk, majd a tenyészetet lengó rázógépen 24 °C-on 48 órán ót rázatjuk. A kapott folyékony tenyészet teljes mennyiségével beoltunk egy 50 l-es fermentorban lévő 30 1 tépközeget, amelyet úgy készítünk, hogy a fenti tápközeghez 0,05% Actcol (Takeda Chemical Industries, Japán) habzásgátló szert adunk, majd a tenyésztést 24 °C-on 48 órán át folytatjuk, 30 1/perc levegöztetési sebesség és 200 fordulat/perc keverés alkalmazása mellett. A kapott folyékony tenyészet 6 1-ét 200 l-es fermentorban lévő 120 1 tápközegbe oltjuk, amely 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% Polypeptont (Daigo Nutritive Chemicals, Japán), 0,5% hús kivonatot (Wako Pure Chemical Industries, Japán), 0,5% nátrium-kloridot, 0,05% nótrium-tionilszulfótot, 2 ppm kobalt-kloridot és 0,05% Actcolt tartalmaz, majd a tenyésztést 24 °C-on 66 órán ót folytatjuk, 120 1/perc levegöztetési sebesség és 170 fordulat/perc keverés alkalmazása mellett. A kapott 105 1 folyékony tenyészet pH-ját 2 n sósavoldattal 6,5-re állítjuk, majd Hyflo super Cel-hez (Jones Manville, USA) adjuk, szűrjük, és vízzel mossuk. 102 1 szürletet kapunk, amelynek pH-ját 6,5-re állítjuk, majd 2 1 IRC-50-nel (Na*-tlpus) töltött oszlopon átfolyatjuk. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 500 ml 2 mól/1 koncentrációjú sóoldattal mossuk. A kapott eluátumot 2 1 aktivszénnel töltött oszlopon ótfolyatjuk, vízzel mossuk, majd 15 1 8% izobutanolt tartalmazó vízzel eluáljuk. A kapott eluátura pH-jót 6,2- -re állítjuk, majd 2 1 térfogatra koncentráljuk és 0,5 1 CM-Sephadex C-25-tel (Na+-tipus) töltött oszlopon ótfolyatjuk. A kívánt vegyületet tartalmazó frakciókat 20 1 0,1 mól/1 koncentrációjú sóoldattal eluáljuk. A TAN-749B-t tartalmazó frakció a kromatogram első felében jelenik meg, és a TAN-749-A-t tartalmazó frakció a kromatogram utolsó felében. A kapott frakciókat 1,0, illetve 4,0 1 aktivszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk, majd sómentesltjük, koncentrációjuk és liofilizáljuk. 4,0 g nyers TAN-749B-t és 8,9 g nyers TAN-749A-t kapunk. A 4,0 g TAN-749B nyersterméket ezután fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással tisztítjuk, a mozgó fázis 8% metanolt tartalmazó 0,02 raól/1 koncentrációjú foszfátoldat (pH 3). Egy kívánt terméket tartalmazó frakciót kapunk, amelyet 0,25 1 Na*-tipusú CM-Sephadex C-25-tel töltött oszlopon kromatografálunk, majd 0,3 1 aktívszénnel töltött oszlopon kromatografálva tisztítunk tovább. A kapott tisztított frakciót ezután koncentráljuk és liofilizáljuk. 0,66 g TAN-749B-di(hidrogén-klorid)-ot kapunk, fehér por formájában. A 8,9 g nyers TAN-749A-t hasonló módon kezelve 4,7 g TAN-749A-di(hidrogén-klorid)-ot kapunk, fehér ?or formájában. 2. referenciapélda Komplett, ferde argon tenyésztett Pseudomonas fluorescens YK-437-et (IFO 14446, FERM BP-1005) 2 l-es Sakaguchi-lombikban lévő 500 ml tápközegbe oltunk, amelyet úgy lészitünk, hogy 2% glükózt, 3% oldható keményítőt, 1% finomítatlan szójabab-lisztet, 0,3% kukoricalekvárt, 0,5% Polypeptont és 0,3% nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldathoz 0,5% precipitált kalcium-karbonátot adunk. A tenyészetet lengő rázógépen 24 órán át 48 °C-on rázatjuk. A kapott folyékony tenyészet teljes mennyiségét 200 l-es fermentorban lévő 120 1 tápkőzegbe oltjuk, amelyet úgy készítünk, hogy a fenti tápkőzeghez 0,05% Actcol habzásgátlót adunk, majd a tenyészetet 24 °C-on 48 órán ót inkubáljuk, 120 1/perc sebességű levegőztetés és 180 fordulat/perc sebességű keverés alkalmazása mellett. A kapott tenyészet 50 1-ét 2000 l-es fermentorban lévő, 1200 1 3% glicerint, 0,1% glükózt, 0,5% Polypeptont, 0,5% hÚBkivonatot, 0,5% nátrium-kloridot, 0,05% nátrium-tioszulfátot, 2 ppm kobalt-kloridot és 0,05% Actcolt tartalmazó tápközegbe oltjuk, és a tenyészetet 24 °C-on 66 órán ót inkubáljuk, 1200 1/perc levegöztetési sebesség és 150 fordulat/perc sebességű keverés alkalmazása mellett. 1150 1 tenyészetet kapunk, amelynek pH-ját 6,5-re állítjuk, majd Hyflo super Cel-hez adjuk és szűrjük, végül vízzel mossuk. 1200 1 szürletet kapunk, amelynek pH-ját 6,2-re állítjuk, majd 20 1 IRC-50-nel (Na*-tipus) töltött oszlopon átfolyatjuk. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 200 1 0,5 mól/1 koncentrációjú hidrogén-klorid-oldattal eluáljuk. A kapott eluátum pH-ját 5,6-ra állítjuk, majd 20 1 Diaion SP-207-tel töltött oszlopon átfolyatjuk, és 120 1 vizzel eluáljuk. A kapott eluátumot 2 1-re koncentráljuk, a koncentrátuirot 3 1 CG-50-nel (NH4*-tipus) töltött oszlopon ótfolyatjuk és az aktív frakciókat 40 1 0,4 - 0,6 mól/1 koncentrácójú sóoldattal élűéi juk. A TAN-749A, B, C és D tartalmú frakciók a kromatogram első felében, míg a TAN-749A-t tartalmazó frakció az utolsó felében jelenik meg. A kapott frakciókat 1,2 1, illetve 2,0 1 aktfvszénnel töltött oszlopon kromatografáljuk, az eluálást 4,0 1, illetve 10 1 8% izobutanolt tartalmazó vizzel végezzük. A csak TAN-749A-t tartalmazó frakciót koncentráljuk és liofilizáljuk, 47,5 g TAN-749A-t kapunk. Három önálló fermentálásból származó, 3450 1 kezdeti tenyészetek megfelelő fermentlevet, vagy a fenti eljárással kapott, TAN-749A-t, B-t, C-t és D-t tartalmazó frakciót együtt koncentráljuk. A kapott 2 1 koncentrótumot 3 1 CG-50-nel (NHF-tipus) töltött oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
