198103. lajstromszámú szabadalom • Enzimes eljárás 3-helyettesített cephalosporinok előállítására
9 198 103 10 TCL (clil-ncclát): Rr*--0.8. 'H-NMR (,60 MHz, CDC13): 5 1,48-1,83 (211, m, CH2CH2Cti2CO), 2,15-2,51 (4H m, CH2CO), 5,05 (2H, s, CH2Ar), 7,25-7,28 (5H, m, Ar-//), 10,91 (1H,s,C02H). m/e (elektronütközés): 236 (M+, 5%), 91 (CH2Ph, 100%). 2) N-[5-(benzüoxi-karbonil)-pentanoü]-S-benzil-L-ciszteinil)-D-valin-benzilészter Hivatkozás a kapcsolási eljárásokra: J. E. Baldwin et al., J. Chem. Soc., Perkin 1.1981. 2253. 787 mg (3,33 mmól) 1) pont szerint kapott megfelelő vegyületet kapcsolunk S-benzil-L-ciszteinnel (trietil-amin/izobutil-klór-formiát használata mellett), és így nyers N-acUezett-S-benzü-L-ciszteln vegyületet kapunk 1,53 g mennyiségben (100%), amelyet nem tisztítunk, de kapcsolunk valín-benzilészter vegyülettel és így nyers cím szerinti 2) vegyületet kapunk. A terméket kromatográfiásan tisztítjuk (sziliciumdioxid, etil-acetát(diklór-metán-elegy), és így tiszta 2) vegyületet kapunk olaj alakjában 309 mg mennyiségben, 50%-os letermeléssel. TCL (10% etil-acctát(diklór-melán): Rf = 0,45. ‘H-NMR (300 MHz, CD3CN): 5 0,87 (3H d, J=7 Hz, CHCH3), 0,88 (3H, d, J=7 Hz, CHC//3), 1,56-1,61 (4H, m, CH2CH2CH2C0), 2,10-2,17 (3H, m, CH2CO, COTS), 2,33-2,37 (2H, m CH2CO), 2,63-2,83 (2H, 8 AB vonal a CHC//2S ABX rendszer AB része), 3,75 (2H, s, SC//2Ar), 4,31-4,36 (1H, m, NCff), 4,51^1,58 (1H, in, NOf), 5,09 (2H, ca s, CH2Ar), 5,51, 5,15 (2H, ABq, J=12 Hz, C//2Ar), 6,70 (1H, d, J=7,5 Hz, NH), 7,03 (1H, d, J=8 Hz, NH), 7,24-7,36 (15H m, Ar-//)-m/e (depressziós kémiai ionizáció): 618 (MH+). Hivatkozás a védőcsoport eltávolítási módszerre: J. E. Baldwin et al., J. Chem. Soc., Perkin 1,1981, 2253. Cseppfolyós ammóniát visszafolyatás közben szárítunk nátrium felett argongáz légkörben és 50- 100 inl-t olyan edénybe desztillálunk, amely 250 mg (0,40 mmól) 2) pont szerinti vegyület 5 ml száraz THF-el készített oldatát tartalmazza -78 °C-on. Ezután frissen vágott nátriumot adunk kis adagokban a reakcióelegyhez keverés közben -78 °C-on addig, ameddig a keletkező kék szín 10 percig megmarad. Ezt követően vízmentes ammónium-szuifálot adunk az elegyhez addig, ameddig a kék szín el nem tűnik, majd az ammóniát és a THF-et argongáz légkörben lepároljuk. A maradékot 20 ml 50 mrnólos vizes kénsav-oldatban szuszpendáljuk, és a keletkező oldatot szűrjük. A kivált csapadékot 10 ml 50 mrnólos vizes kénsav-oldattal mossuk, a szűrletet és a mosófolyadékokat egyesítjük, és 0,40 ml Hopkins-féle reagenshez adjuk mindaddig, ameddig csapadék képződik. A kivált csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és 3X10 ml vízzel mossuk. A maradék szilárd 6 anyagul vízben s/.us/.pendáljuk. és hidingéu-s/.ulfidot buborékoltatunk át az oldaton körülbelül 40 percig. A fekete színű elegyet celiten szűrjük és 10 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük és szárazra pároljuk, így 85 mg cím szerinti vegyületet kapunk 60%-os kitermeléssel. ‘H-NMR (300 MHz, CH3OD): ô 0,90 (3H, d, J = 7 Hz, CHC//3), 0,95 (3H, d, J=7 Hz, CHCH3), 1 58-1,74 (4H, m,C//2CH2CH2CO), 2,08-2,23 (1H, m, C//CH3), 2,24-2,40 (4H, in, C//2CO), 2,77-2,94 (2H, 8 vonal Ab az ABX rendszer része, CHC//2S), 4,20 [1H, d, J=5 Hz, C//CH(CH3)2], 4,49-4,58 (lH,m,C//CH2S). m/e (erős atombombázás). 349 (MH+). 4. előállitámód 6/?-(5-karboxi-pentán-ainido)-2,2-,dimetil-penam-3-karbonsav 1) Általános inkubálási módszer IPNS-re Megközelítően 3 mg anyag vizes oldatát 0,100 ml 100 mrnólos vizes ditiotreit-oldattal, 0,100 ml 50 mrnólos vizes L-aszkorbinsav-oldattal, 0,050 ml (10 000 cgység/ml) murhamáj-katalázzal és 3,5 ml 50 mrnólos NH4HC03 oldattal keverjük. A pH-érték csökken, amelyet szükség esetén 8-ra állítunk be 100 mrnólos hígított NaOH-oldattal. A keletkező oldatot 27 °C-on 5 percig rázzuk, és körülbelül 5 l.U./ml egységnyi, 1 ml izopenicillin N szintetáz készítményt, amelyet Cephalosporium acremoniumból különítettünk el, 50 mrnólos NH4KC03 oldatban, adunk az oldathoz. Az inkubációs elegyet két 10 ml-es fiolában rázzuk 27 °C-on 45 percig, majd a. reakciót 7 ml aceton hozzáadásával a protein kicsapása útján megállítjuk, és a kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Az acetont vákuumban eltávolítjuk, és a reakciótennéket NMR proton (500 MHz) segítségével kicsapjuk és fagyasztva szárítjuk a maradékot. 2) Adipoil-(L)-ciszteinil-(D)-valint inkubálunk IPNS-el együtt az előző általános módszer szerint. A nyers inkubációs elegyből HPLC-vel a következő vegyületet különítjük el: (2S,5R ,6R)-6-(5 -karboxi-pentán-amido)-3,3-dimetil- 7-oxo-1 -aza-4-tiabiciklo (3.2.0] heptán-2-karbonsav ‘H-NMR (300 MHz, D20): 6 135—1,55 (4H, m, C//2C//2C//2CO), 136 (3H, s, 3-Me), 1.48 (2H, s, 3-Me), 2,05-2,32 (4H, 2Xm, CH2CO), 4,08 (1H, s, 2-H) és 5,29, 5,39 (2H, 2Xd, J=Hz, 5-H, 6-H). Tisztítás: fordított fázisú oktadecil-szilán HPLC (250X4,6 mm*es oszlop); Mozgó fázis: 50 mrnólos NI14HC03 vizes oldat; folyási sebesség 1 ml min“1; Tartózkodási idő = 6,1 perc. Biopróba: pozitív Staphylococcus aureus ellen. Más változat szerint a fagyasztva szántott inkubációs elegyet 2 ml vízben szuszpendáljuk, a szuszpenziót 2 normál HCl-oldattal 1 pH-ra savanyítjuk, és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
