198091. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gangliczidszármazékok és az azokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 19S 091 4 galoniban cgykompotiensű gangliozidként vagy gangliozidok elcgycként kapható (például a Sigma által gyártott Gm gangliozid), vagy természetes forrásokból (agy, vér, vérsejtek, stb.) extrahált gangliozidtartalmú anyag, például acetonos por formájában van, melyet ismert módon állítunk elő, vagy állati agyvelőből, célszerűen ökör agyából nyert, fagyasztva szárított agyban található, vagy in situ állítjuk elő, egy vagy több poliszialo-gangliozidból, a találmány szerinti eljárás 1. lépésének körülményei között. A találmány szerinti eljárásban a kívánt termékek előállítására használt gangliozidok célszerűen alapvetően tiszta formában vannak — azaz 50%-nál kevesebb, célszerűen 20%-nál kevesebb, és előnyösen 10%-nál kevesebb szennyezést tartalmaznak—, amit a gangliozidok tisztítására szokásosan alkalmazott tisztítási műveletekkel, például oszlopkromatográfiás eljárással [L. Svennerholm: Methods in Carbohydrate Chemistry 6, 464-474] érhetünk el. Az 1. lépésben használt vizes oldatot előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a gangliozidot kalciumionokat tartalmazó vizes oldattal — például vizes kalciumklorid-oldattal — elegyítjük oly módon, hogy az oldatban a kalciumion koncentráció 1-10 mmól/1, előnyösen közel 5 mmól/1 legyen, majd az elegyet alaposan összekeverjük. A vizes oldatot úgy is előállíthatjuk, hogy a gangliozidot kalcium-kationokat tartalmazó vizes oldattal — például kalcium-hidrogén-karbonátot tartalmazó vizes oldattal — szemben dializáljuk, 1—10 mmól/1, előnyösen közel 5 mmól/1 kalciumion koncentráció eléréséig. A dialízist célszerűen 24—72 órán át, előnyösen 48 órán át folytatjuk. A fenti dialízisben használt víz vagy természetes víz, vagy kalciumionokat tartalmazó desztillált víz, vagy olyan desztillált víz lehet, amelyhez hozzáadtuk a fenti ionokat. A koncentrálást megelőzően kis mennyiségű 1-4 szénatomos alkanolt, előnyösen metanolt adunk a vizes oldathoz. Azt tapasztaltuk, hogy az oldat össztérfogatához viszonyítva 25 térfogat % metanol hozzáadása különösen célszerű abban az esetben, ha a vizes oldatot dialízissel állítottuk elő, a metanolt előnyösen a dialízis után adjuk az oldathoz. A koncentrálási lépésben a koncentrálandó oldat mennyiségét célszerűen állandó értéken tartjuk azáltal, hogy az elpárologtatott vizet további, gangliozidot és kalciumkationokat tartalmazó oldattal pótoljuk. Ezáltal egy szokásos műveletben a vizes oldat teljes térfogatát 10—40-cd részére csökkentjük. Célszerűen vákuumban dolgozunk — általában 2.58X103- 6.45X103 Pa nyomáson —, a belső hőmérsékletet 55 és 80 °C közötti értéken, célszerűen 59.5 °C-on tartjuk, 60 és 90 °C közötti, célszerűen 67.5 °C-os külső hőmérséklet alkalmazásával. A fenti körülmények között a koncentrálási művelet előnyösen folyamatos, és lineárisan progresszív. A koncentrálást célszerűen 110 óránál rövidebb idő alatt hajtjuk végre. Abban az esetben, ha a koncentrálást 59,5 °C-os vizes oldatban hajtjuk végre, a műveletet célszerűen 55 órán át folytatjuk. A 2. lépésben a koncentrált oldat pH-ját szerves vagy ásványi savval, előnyösen pH 2,6 körüli értékre állítjuk. Savként célszerűent sósavat használunk, amelynek koncentrációja célszerűen 6 n. A dialízist célszerűen desztillált vízzel, vagy plI 2,6 körüli értékű híg savoldattal - előnyösen híg sósavoldattal — szemben végezzük, melyet desztillált vízzel szembeni dialízis követ. A desztillált vizet felhasználás előtt célszerűen újradesztilláljuk. A dialízist általában 1 és 10 °C közötti hőmérsékleten, célszerűen 4 °C-on végezzük, körülbelül 24-72 órán át, célszerűen 48 órán keresztül. A vizes oldat bcpárlását a 3. lépésben hagyományos módon, például fagyasztva szárítással végezzük, azaz a vizes oldatot megfagyasztjuk és a vizet vákuumban elpárologtatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított GmiP gangliozidok rendszerint 80%-nál kevesebb, célszerűen 50%-nál kevesebb, még célszerűbben 20%-nál kevesebb, előnyösen 5%-nál kevesebb szennyezést - például Gmi gangliozidot, más gangliozidokat vagy gangliozid-származékokat - tartalmaznak. A találmány szerinti eljárással előállított GmiP gangliozidokat az átalakulatían gangliozidoktól úgy választhatjuk el, hogy az átalakult és átalakulatían gangliozidok keverékének vizes szuszpenzióját amely kis mennyiségben metanolt is tartalmaz ■- desztillált vízzel szemben dializáljuk, és a kapott szuszpenziót fagyasztva szárítjuk. A találmány szerinti eljárással előállított GMiP gangliozidok Rf értéke 0,245, a Gmi gangliozid 0,31 Rf értékével szemben, vékonyréteg-kromatográfiás meghatározás szerint (réteg: Merck Silica Gel 60 F 254, 110 °C-on 30 percen át melegítve; rétegvastagság: 0,25 mm; eluens: kloroform-metanol-víz 55 :45 : 10 arányú elegy; a réteget az eluálás előtt 1 órán át telítjük), azonban a fenti érték eléri a Gmi gangliozidok Rf értékét, ha a GMiP tisztaságát növeljük. A lemezt kénsawal (koncentrált kénsav és víz 1:1 arányú elegye), rezorcinol reagenssel, orcinol/FeCl3 reagenssel, és más jellegzetes, gangliozidok detektálására használt reagenssel bepermetezve pozitív reakciót kapunk, de ninhidrines permetezéssel (0,2% ninhidrin, etanolban) gyenge reakció tapasztalható. A GmiP gangliozidok NMR-spcktruma a 2. ábrán látható. A fentieknek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított GmiP gangliozidok jellemzője, hogy a) vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatban (i) kénsav-reagenssel (koncentrált kénsav és víz 1 : 1 arányú elegye), rc/orcinol-rcagcnsscl, orcinol/FeCl3 reagenssel és más jellegzetes gangliozid-reagenssel pozitív reakciót ad, (ii) ninhidrin-reágenssel (0,2% ninhidrin etanolban) csak gyengén reagál, b) vizes oldatban felvett NMR-spektruma lényegében a 2. ábra szerinti, c) egereken végzett in vivo vizsgálatban hatásos Klebsiella pneumoniae ellen (a vizsgálatot alább ismertetjük), és d) egereken in vívó végzett vizsgálatban Herpes HSV—1 (F törzs) elleni hatást mutat (a vizsgálatot alább ismertetjük). A Gm, monoszialo-gangliozid vizes oldatban felvett 13C-NMR-spektrumát (1. ábra), és a találmány szerinti eljárással előállított GmiP gangliozid meg5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
