198085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, véralvadásgátló hatású hirudinszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
7 198 085 8 kai, így oldószerrel, cnndgeálorral, ixotóniáz bcdílító szerrel, konzerváló-anyaggai vagy más segédanyaggal keverjük, és így oldatot, szuszpenziót, vagy emulziót készítünk. A készítmény előállításához oldószerként használhatunk vizet, fiziológiás konyhasó-oldatot, alkoholokat, így etanolt, propanolt vagy glicerint, továbbá cukor-oldatot, így glukóz- vagy mannitoldatot, vagy a fent említett oldatok elegyét. Hordozó-anyagként általában szervetlen vagy szerves anyagokat alkalmazhatunk. Ezek közül megemlítjük a vizes oldatokat, így például a pufferrendszereket, vagy víz és vízzel elegyedő oldószereknek izotóniás elegyét, továbbá például alkoholokat vagy aralkilalkoholokat, olajokat, poli(alkilén-glikolokat), etil-cellulózt, karboxi-metil-cellulózt, poli(vinil-pirrolidon)t vagy izopropil-mirisztátot, Pufferanyagként alkalmazhatunk például nátrium-borátot, nátrium-foszfátot, nátrium-acetátot vagy glukonátpuffert. Használhatunk ezen kívül egyéb, nem toxikus segédanyagot, így emulgeáló-, konzerváló-szereket, nedvesítőszert, mint például polictilén-glikolt, és antibakteriális anyagokat. 1. példa Inhibitor koncentráció meghatározás troinbintitrálással 10—100 pl inhibitor oldatot 200 pl nátrium hidrogén-karbonát-oldattal (pH = 7,1-0,05 mól) elegyítünk. Ehhez 0,1 ml 0,5—1,0%-os fibrinogén-oldatot vagy hígított citrát-plazmát adunk. Szabályos időközökben, szobahőmérsékleten, keverés közben 50— 100 pl alikvot trombin-oldatot adunk az elegyhez. A trombin-oldat 100 NIH egységet tartalmaz Im-enként. Félkvantitatív vizsgálatoknál a folyadék olvadáspontját adott időközökben ellenőrizzük, vagy kvantitatív meghatározásoknál 546 nm-nél turbimetriás vizsgálatokat végzünk. 2 2, példa A kísérletekhez nem tenyésztett szabadon élő vérpiócákat (Hirudo medicinalist) gyűjtöttünk. 150—200 g fagyasztott, hátsó felétől megszabadított piócát 1 liter jéghideg 0,09 %-os nátrium-kloridoldattal és 10 ml oktanollal 3 perc alatt keverőben homogenizálunk. Az elegyet 30 percig 0 °C hőmérsékleten és 10 000 fórdulat/perc fordulatszám mellett centrifugáljuk. A felülűszót két réteg gézen átszűrjük, majd a szűrlctct keverés közben 15 perc alatt 80 °C hőmérsékletre felmelegítjük. A keletkező csapadékot 4 réteg gézen átszűrjük. A szűrletet jeges hűtés és keverés közben 4 °C hőmérsékletre lehűtjük, majd 7,5 liter előre lehűtött (—20 °C) acetonba öntjük. Újra csapadék képződés lép fel; a csapadékot 5 perc után üvegszűrőn leszűrjük, majd 1 liter hideg acetonnal (—20 °C) mossuk. A kapott anyagot vákuumban szárítjuk, 520 mg halvány sárgás színű port kapunk; fehérje-tartalom; 62% (Lowry-féle módszerrrel végezve a meghatározást). Az antitrombin hatás mint?gy 400 cgység/mg, azaz 1 mg anyagban 40- 50 pg hirudin-származék található. Az így kapott anyagot 75 ml vízben feloldjuk, majd az oldat pH-ját 5 n ammóniával 8,0-ra beállítjuk, ezt követően az oldatot 1 óra hosszat 0—4 C hőmérsékleten keverjük. Az oldhatatlan részt 30 percen belül 5000 ford/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Víz hozzáadásával a fehérje-tartalmat 25 mg/ml (Lowry) koncentrációra állítjuk be. Ezt követően az oldathoz 35 ml telített ammónium-szulfát-oldatot adunk és 1 óra hosszat 4 °C hőmérsékleten keverjük. Az első csapadékot centrifugálással gyorsan elkülönítjük (5000 ford/perc/30 perc), majd az oldalhoz, adunk 26 g ammöninm-szulfatol, és a pH-t jégecettel 4-re beállítjuk. 5 óra múlva az egész szuszpenziót centrifugáljuk, majd a kapott nedves csapadékot 200 ml 0,1 mólos ammónium-hidrogénkarbonát-oldatban feloldjuk; (pH = 8), majd 250 ml Amiconu segítségével 5 PM 10-cs membránon (szűrési határérték: 10 000 Dalton) ultraszűrést végzünk. Eközben az oldatot mintegy 40 ml-rc betöményítjük és a rendszert a művelet vége felé 150—150 ml 0,1 mól-os ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal (pH = 8) utántöltjük. A maradékot fagyasztva szárítjuk; így 350 mg anyagot kapunk. Fehérje-tartalom: 89%, azaz a maradék egyéb anyagokat is, így például sókat is tartalmaz. Ily módon 500 mg anyagot állítunk elő, amelyet 5 ml oldószereleggyel feloldunk. Az oldószer-elegy összetétele: kloroform-metanol-jégecet-víz-trietil-amin 1200:1200 :4 :400:12 arányban 0,2 % ammónium-acetáttal elegyítve. Keverés közben (vibrátoros keverő segítségével) Merck-féle C-oszlopot kovasavval (50 pm, 100 Ä) töltünk meg, és az oldatot az oszlopra felvisszük. Az oszlopot fenti oldószer-eleggyel eluáljuk. Az eluálás sebessége 4 ml/perc. öt—tíz ml-es frakciókat különítünk el. Az eluátumot szárítjuk, az inhibitor-tartalmú frakciókat 0,5 mól-os 7 pH-jú nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban feloldjuk és egyesítjük. Hozam: mintegy 50 mg anyag; aktivitás: 4000 ATU/mg, azaz a protein-elegyben a hirudin-származék koncentráció: 30%. Az így kapott anyagból 20 mg-ot 200 pl 2,16 pH-jú vízben feloldunk (a pH beállítást trifluor-ecetsavval és 5 %-os acetonitrillel végezzük), majd az oldatot oktadecilszilán-kovasavval (5 pm) töltött acéloszlopra (ShandonRODS) injektáljuk. Az oszlopot maximum 2%/perc grandienssel eluáljuk. Kezdeti pufferként 2,16 pH-jú víz+ 5% acetonitril elegyet, végpufferként acetonitril és víz (pH = 2,16) 80/20 elegyét használjuk. A frakciókat külön-külön összegyűjtjük. A frakciókban két (I) általános kcplctű vegyüld elegyét kapjuk, éspedig amely képletében X jelentése He, . R jelentése H, Y jelentése Thr, m értéke 1 (2. ábra IR-spektrum) és amely képletében R jelentése 11 vagy-S03H Y jelentése Thr m értéke 0 (1. ábra IR-spektrum). A 2. ábra kiértékelését a 3. példában, az 1. ábra jellemző sávjait a 4. példában közöljük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
