198085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, véralvadásgátló hatású hirudinszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

9

198 085

10

Szárítás után a (II) általános képletű hirudinszármazék (a képletben R jelentése hidrogénatom, vagy —SOjH csoport) specifikus aktivitása megfelel az 1 :1 arányban trombinnal képzett komplex aktivitásának.

Kitermelés: 4 mg (a 20 mg felhasznált „inhibitorra" vonatkoztatva).

A következő példánkban a (H) hirudin-származék elnevezés a (11) általános képlctű poUpcplidet jelenti, amely képletében R jelentése H vagy S03H.

Fiziológiailag elfogadható sók előállítása Szerves só előállítás

4 mg (II) általános képletű hirudin-származék trifluor-acetátját feloldjuk 500 jrl 10 mmól/I piperazinacetát-oldatban (6 pH-ra beállított oldat) és ezt egy előzőleg (piperazin/ecetsav pufferral) egyensúlyba hozott 5/5 mono Q(R) oszlopra (Pharmacia termék)

(11) általános képlctíí spricceljük. A hirudin-származék-acetátját 10 mmól/1 piperazin-acetát oldattal és 1 mól/1 ainmónium-acetát oldattal az oszlopról elítéljük (UV monitoron 280 nm en ellenőrizzük), majd az eluátumot vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk. Kitermelés: 3,8 mg.

Az aminosavelemzés eredménye megfelel az elméleti értékeknek.

A találmány szerinti eljárással előállított acetátok illetve trifluoracetátok IR-diagramjait szemléltetik a

4., 7., 10., illetve az 5., 8., 11. ábrák. Az IR-spektrum jellemző sávjai:

OH, NH és H-O-H sávok 3240-3340 cm“1, CH-sávok: 2900-3100 cm“ *, amid-(I)-sávok: 1620—1670 cm“1, amid-(II)-sávok: 1500—1550 cm“1.

Aminosavelemzés

(II) általános képletű hirudinszármazék acetátja

(II) általános képletű hirudinszármazék trifluoracetátja

talált

számított

talált

számított

Asp

9,03

9

7,73

9

Thr

4,74

5

4,81

5

Ser

3,69

4

3,77

4

Glu

13,33

13

14,60

13

Pro

2,74

3

3,66

3

Gly

8,69

9

10,77

9

Val

1,45

Z

2,36

2

Cvs

4,94

6

5,35

6

Ile

2,88

3

3,07

3

Leu

3,97

4

4,66

4

Tyr

1,98

2

2,18

2

Phe

1,01

1

1,28

1

Lys

3,06

3

3,19

3

His

1,03

1,

1,17

1

Szén e tlcn só-eh hí Ilit ás

[(II) általános képletű hirudin-származék-foszfátja előállítása]

2,1 mg (II) általános képletű hirudin-származéktrifluoracetátját feloldjuk 500 /il 15 mmól/1 piperazin-foszfát oldatban (amelynek pH-ját foszforsavval 2 pll-ra beállítottuk), és az oldatot 5/5 Mono S1* (Pharmacia)-kolonnára fecskendezzük. A kolonnát előzőleg ugyanazzal a pufferral (piperazin-foszfát) egyensúlyba hoztuk. A (II) általános képletű hirudinszármazék-foszfátját a kolonnáról a következő pufferral cluáljuk: 15 mmól/1 piperazin-foszfát; 1 mól/1 lítium-perklorát, amelynek pH-ját foszforsavval 2-re beállítottuk. A detektálás UV-detektorral 280 nm-en történik. Az eluátumot vízzel hígítva és sótalanítás után fagyasztva szárítjuk.

Kitermelés: 1,6 mg.

Az előállított foszfátsók IR-spektrumait szemléltetik a 6., 9. és 12. ábrák. Az IR-spcktrumok jellemző sávjai:

OH, NH és H-O-H sávok: 3240-3340 cm“1. CH-sávok: 2900-3100 cm“1,

amid-(I)-sávok: 1620-1670 cm“1, amid-(II)-sávok: 1500—1550 cm“1.

Hasonló módon állítjuk elő a többi fiziológiailag elfogadható savaddíciós sókat, így például a formiátot (az ecetsavat hangyasavval cseréljük fel), a citrátot, foszfátot, kloridot, 1,8-naftalin-diszulfonátot, karbonátot, benzoátot, valamint a malonsav- és aszkorbinsav-sóit.

A következő 3—5. példákban kiindulási anyagként alkalmazott (III) képletű Val1-Val2-Tyr3-Thr4-Asps- Cys6-aminotei minális hirudin-származékot a ,JP. Walsmann: Thrombosis Research 40, (1985) 563—569” irodalmi helyen közölt eljárással természetben előforduló vérpiócából kapjuk meg. Ez a kiindulási anyag szulfátéit formában keletkezik, vagyis a Tyr62, illetve a Tyr63 aminosavmaradékon - S03II csoporttal van helyettesítve. A találmány szerinti eljárásban szintetizált hirudin-származékok részben deszulfatálódnak, így mindig olyan (I) általános képletű adott hirudin-származékok keverékét kapjuk, amely R-jelentésében H és szulfocsoport.

A végtermék deszulfatálódásának mértékét nem lehet meghatározni, és így az így keletkező terméket nem lehet szétválasztani.

3. Példa

l'reparativ Edman-lebontás

A (III) képletű Val1 -Val2 -Tyr3 -Thr4-Asp5 -Cys6 - amino terminális hirudin-származékból 10 mg-oí feloldunk 10 ml 1:1 arányú piridin/víz oldatban.

. Nitrogéngázzal kezeljük és 500 /ul fenil-izotiocianátot adunk hozzá. A reakcióelegyet két órán keresztül nitrogénatmoszférában 54 °C hőmérsékleten erősen keverjük. Vízfürdőben lehűtjük és 60 ml hepíán/etilacetát (2 :1) oldattal extraháljuk, majd a keletkező két fázist elválasztjuk, és az alsó fázist megtartjuk. Az

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

6