198085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, véralvadásgátló hatású hirudinszármazékok és az ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
6 ! a Lys-en levő e-aminocsoporthoz kötött karbamoil-származék-csoportot és az uretán védőcsoportot lehasítjuk és a kapott polipeptidet kívánt esetben fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk, vagy c) az (I) általános képletű polipeptidek előállítására a képletben X jelentése Ile, vagy Leu, Y jelentése Thr, R jelentése H vagy—SO3II, m értéke 1 —, a (III) képletű Val'-Val2-Tyr3-Thr4-Asps-Cys6- aminoterminális hirudin-származékot piridin/víz pufferban izocianáttal, előnyösen fenil-izotiocianáttal reagáltatjuk, és az első anrinosavat lehasítjuk, majd a reakciót megismételjük, és az így kapott peptidet egy U(X)m—Y—OH általános képletei pepiid rcakcióképcs származékával, így azidjával reagáltatjuk - a képletben m, X és Y jelentése a fentiekben megadott, U jelentése a peptidkémiában ismert uretán védőcsoport — a Lys-en levő e-aminocsoporthoz kötött karbamoil-származék-csoportot cs az uretán védőcsoportot lehasítjuk, és a kapott polipeptidet kívánt esetben fiziológiailag elfogadható savaddíciós sóvá alakítjuk. A fiziológiailag elfogadható sók közül előnyösek az acetátok, a citrátok, a foszfátok, a kloridok, az 1—8 naftalin-diszulfonátok, a karbonátok, a benzoátok, valamint a malonsawal és az aszkorbinsavval alkotott sók. A b) és c) eljárásokban az aminosavak véghelyzetű aminocsoport) át védőcsoporttal látjuk el, és ily módon reagáltatjuk. Az aminocsoporton védőcsoportot tartalmazó első aminosavat észtérképzésse! visszük fel a hordozóanyagra. Az aminocsoport védőcsoportjának eltávolítása után a következő aminosavat (amelynek aminocsoportja szintén védőcsoporttal van ellátva) kapcsoló-reagens segítségével (így diciklohexil-karbodiimiddel) visszük fel a hordozóra. A védőcsoport eltávolítása, majd újabb aminosav felvitele következik; a műveletet mindaddig folytatjuk, amíg a kívánt aminosav-sort össze nem állítottuk. A védőcsoportokat és a kapcsolási eljárást az aminosavtól függően választjuk meg. Az aminocsoport védőcsoportjaként szerepelhet valamely ismert uretán védőcsoport, így benzil-oxikarbonil (Z), p-metoxi-karbo-benzoxi-, p-nitro-karbobenzoxi-, terc-butil-oxi-karbonil (Boc), Fmoc stb. Előnyösen Boc-csoportot használunk, minthogy ezt a csoportot viszonylag gyenge savval is (így például trifluor-ecetsawal vagy szerves oldószerrel készült sósav-oldattal) lehasíthatjuk. A treonint benzil-éter formájában, a lizin-aminocsoportját Z származék alakjában védhetjük. Ezek a csoportok a Boc-csoporl lehasításához használt reagensekkel szemben messzemenően ellenállók; e csoportokat katalizátor jelenlétében (Pd/aktívszén) végzett hidrogénezéssel, vagy például folyékony ammóniában alkalmazott nátrium segítségével távolíthatjuk el. A védőcsoporttal ellátott peptidet például hidrazinnal távolíthatjuk el a gyantáról. E műveletnél 5 4 Itidrazid keletkezik, amit például N-bróm-szukcinimiddel kezelve [Int. J. Pept. Prot. Research 17, 6—11, (1981)] szabad karbonsavvá lehet alakítani Amennyiben ez szükséges, a diszulfid-hidakat oxidációval zárjuk (1. König, Geiger: Perspectives in Peptide Chemistry, 31-44, Karger, Basel), A b) és c) eljárásoknál a (III) képletű Val'-VaPTyr3-Thr4-Asp5-Cys6 aminoterminális hirudin-származékot kétszeres Edman-féle lebontásnak vetünk alá; e műveletnél a polipeptidet megfelelő puffer-oldatban, így piridin/víz, vagy dioxán/víz elegyben, bázis, így nátrium-hidroxid vagy trictil-amin hozzáadásával, előnyösen 40 °C hőmérsékleten, 8—9 pH értéknél, izotiocianáttal, előnyösen fenil-izotiocianáttal reagáltatjuk. Savval való kezeléssel (például 3 n HCl-val szobahőmérsékleten, majd 40 °C-ra való felmelegítéssel) az N-terminális-valint fcnil-tiazolinon formájában hasítjuk le. E/.l a műveletet mégegyszer megismételve lehasíthatjuk a második N-terminális valinl is. Fentiek szerint eljárva Dez-(Va!)2-hirudin-származékot kapunk, majd az így kapott származékot az U-(X)m-Y-OH általános képletű peptid reakcióképes származékával reagáltatjuk. A képletben a szubsztiliicnsek jelentése a fentiekben megadottal azonos. Erre a célra előnyösen p-nitro-feni!-, eianometil-, N-hidroxi-ftalimid- vagy igen előnyösen N- hidroxi-szukcinimid-észtert használunk. Uretán védőcsoportként (U) célszerűen olyan csoportokat használunk, amelyek savas vagy bázikus közegben lehasithatók, mint például a Boc vagy a Mse csoport. Amennyiben az szükséges, az oldalágban esetleg jelenlévő funkciós-csoportot átmenetileg megfelelő védőcsoporttal látjuk el. A fentiek szerint előállított, védőcsoporttal ellátott (I) általános képletű polipeptidet megfelelő oldószerben, így rövidszénláneú alkoholban vagy ennek vízzel képzett elegyében hidrazin-hidráttal reagáltatjuk. Ily módon a liziri molekulán levő fenil-tiokarbamoilcsoportot lehasíthatjuk. Ezt követően a polipeptidről már csak a még jelenlévő védőcsoportokat kell lehasítani; így a Boc csoportot trifluor-ecetsawal, az, MSC csoportot bázissal távolítjuk el, A művelet végén a találmány szerinti (I) általános képletű polipeptidet kapjuk. A találmány szerinti polipeptidek a trombint specifikusan gátolják. A trornbin-gátlás kvantitatív mérése során azt tapasztaltuk, hogy a polipeptidtrombin-komplex gyakorlatilag nem disszociál. E vizsgálat segítségével a feldolgozás és tisztítás során ellenőrizhetjük a taláimányszerinti polipeptid hatását, és ezen keresztül tisztaságát. A fentiek szerint tisztított (II) általános képletű polipeptid tronrbingátló hatása 10 000 ATU/rng érték felett is lehet, ami azt jelenti, hogy a polipeptid hatásosabb, mint az ismert hirudin. A találmány szerinti eljárással kapott polipeptidet szokásos módon gyógyászati készítménnyé alakíthatjuk, . A találmány szerinti polipeptidet tartalmazó készítményt párénterálisan vagy helyi kezelésben alkalmazhatjuk. A szubkután vagy intravénás alkalmazásra szánt készítményhez a találmány szerinti polipeptidet vagy' ennek fiziológiásán megfelelő sóját szokásos anyagok-198 085 5 10 15 20 75 30 35 40 45 60 55 60 65
