198075. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vinblasztin konjugátumok és származékaik, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
19 198 075 20 loidtartalmat radioaktivitás mérésével határozzuk meg. A kapott konjugátum 7 mól alkaloidot tartalmaz J mól galaktozilált humán albuminra számolva. Kitermelés: 75 %. HPLC BSA 49% 19,034 APÓ 38% 17,677 IgMdi 5% 14,794 IgM di 8% 13,860 Az új vcgyülctck farmakológiai hatását az alábbi vizsgálatokkal teszteltük: 2. Lizozótn enzimekkel szembeni érzékenység A konjugátumok lizozóm enzimekkel szembeni érzékenységét úgy vizsgáltuk, hogy a konjugátumot 48 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten 5 mmól/liter acetát-puffer és lizozóm enzim jelenlétében inkubáituk. 48 órás inkubálás után a sértetlen fehérjét 5 mg szérum albumin és 2 térfo|atrész acetonitril segítségével kicsapjuk. A mintát 4 °C hőmérsékleten 40 percig inkubáljuk, majd 3000 fordulatszámon 40 percen keresztül centrifugáljuk. A felülúszó radioaktivitását folyadék-skintillációs számlálóval határoztuk meg egy alikvot részben. Az oldott radioaktivitás a konjugátum emésztési fokára utal. A vizsgálatok során a következő emésztési százalékokat kaptuk: Példaszám: 17. 92% 18. 100% 20. 75% 22. 79% 23. 92%. 2. Szérumstabilitás A konjugátumok szérum jelenlétében mutatott stabilitását úgy mértük, hogy a konjugátumot 62 tömeg%-os borjúmagzat-szjérum jelenlétében 37 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül inkubáltuk. 48 órás inkubálás után a sértetlen fehérjét 1 térfogatrész triklór-ecetsav (40 tömeg%-os TCA) hozzáadásával kicsapjuk. A mintát 4 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd centrifugáljuk és a felülúszó radioaktivitását folyadékszkintillációs számláló segítségével egy alikvot részben meghatározzuk. Az oldott radioaktivitás a konjugátum emésztési fokára utal. A vizsgálati eredmények szerint a konjugátumok 48 órán keresztül stabilak. 3. Savas stabilitás A konjugátumok savas pH-n mutatott stabilitását úgy vizsgáltuk, hogy a konjugátumot 40 mmól/liter acetát-puffer (pH =4,5) jelenlétében 37 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül inkubáltuk. Az emésztés mértékét TCA kicsapásos módszerrel határoztuk meg. A mérési eredmények szerint a konjugátumok a fenti körülmények között stabilak. 4. Kemoterápiás aktivitás Leukémia P 388 esetében A kiindulási anyagként alkalmazott származékok és a konjugátumok kemoterápiás aktivitását Leukémia P 388 esetén vizsgáltuk BDFj nőstény egereknek intraperitoneálisan adagolva. 106 tumorsejtet inokuláltuk i. p. a 0-dik napon. A konjugátumot i. p. adagoltuk az első napon. Az ILS érték a kezelt egerek százalékos túlélési arányát mutatja a kezeletlen egerekhez viszonyítva. A mólarány az alkaloid mólarányát mutatja a galaktozilált humán albumínra számítva a vizsgált konjugátumon belül. A táblázatok a fentiek mellett tartalmazzák a 60-dik napon túlélt egerek számát, valamint a milligramm /kilogramm/nap egységben kifejezett dózist a konjugátum esetén külön az alkaloidra és külön a fehérjére számítva. A kiindulási anyagok hatékonysága Vizsgált anyag Példaszáma Dózis mg/kg/nap ILS (%) Túlélés 60 nap után VBL (vinblasztin) 3 77 0/10 VCR (vinkrisztin) 2,7 64 0/11 9. példa 25 100 0/7 50 127 0/7 75-70 0/6 11. példa 50 88 0/10 100 111 0/10 12. példa 50 148 0/7 100-79 0/7 10. példa 25 102 0/8 50 218 1/7 100- 83 0/7 14. példa 50 37 1/7 100-19 1/5 15. példa 25 185 1/5 50 >633 6/8 100 7 1/7 A konjugátumok hatékonysága Vizs- Dózis gált anyag példaszáma mg/kg/nap Vinka alka- Fehérje lóid Mólarány ILS (%) Túlélés 60 nap után VBL 3 77 0/10 VCR 2,7 64 0/11 60 374-466 13,5-10,7 69 0/5 17. 80 450 15 133 1/5 100 562 15 201 0/5 130 2766 6.6 175 1/3 150 3035 4.1 138 0/7 150 1276 9.8 >552 3/5 150 913 13.7 >574 3/5 21. 60 768 5.7 47 0/5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
