198054. lajstromszámú szabadalom • Eljárás repamicin-származékok és hatóanyagként az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 2 rációjú foszfát-puffer), 25 és 27,5 °C-on végezzük. A/ oldathoz nem adunk antioxidánst, és a puffereket nem oxigén mentesítjük. A plazma-vizsgálatokat patkány és hunián plazmával 37,5 °C-on végezzük. A patkány palzmát hím, albino Sprague-Dawley patkányokból nyertük, és néhány napon belül felhasználtuk. A humán plazmát a Lawrence Memorial Hospital (Lawrence, Kansas, Amerikai Egyesült Államok) adta. A plazma-vizsgálatokat három pro-drog koncentrációban (200, 100 és 50 pg/ml) végezzük. A kísérletet a következőképpen végezzük. A vizsgálandó vegyületből 5 mg/ml koncentrációjú vizes törzsoldatot készítünk, és az oldatból megfelelő térfogatot a plazmához adva beállítjuk a kívánt pro-drog koncentrációt. Előre meghatározott időpontokban 200 jul-nyi mintákat .veszünk, és a reakciót 200 jul 10%-os metafoszforsav hozzáadásával befagyasztjuk. A centrifugálás előtt 200 pl metanollal még teljesebb mértékben kicsapjuk a plazma-proteineket. Az eredményeket félélettartammal (t,,,) fejezzük ki, órában. A kémiai stabilitás és plazma-vizsgálatok után nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatot is végeztünk, Rp C-18 oszlopot (150 mm) és 50 mm-es előtét-oszlopot használva. A mozgó fázis 87:13 térfogatarányú metanoi-foszfát-puffer (0,025 mmól/l, pH 3,4). Az abszorpciót 254 nm-en mértük, az átfolyási sebesség rapamicin vizsgálatánál 1 ml/perc, a pro-drogok vizsgálatánál 1,5 ml/perc. A diagrampapír sebessége 2,54 cm/10 perc. A májhomogenizátum vizsgálatokhoz a májat frissen preparáltuk hím, albino Sprague-Dawley patkányokból. Sorensen-féle pufferre! (pH 7,4) 20%-os májhomogenizátumot készítünk. A rapamicin és a 2. és 3. példa szerint előállított két pro-drogja kémiai stabilitását 20, 50 és 50 pg/ml koncentrációban vizsgáljuk, 37,5 °C-on. A rapamicin hidrolízis-adatait pufferben, plazmában és májhomogenizátumban az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat Kémiai stabilitási vizsgálat A. 25 °C 3,3 35,8 7.4 47,6 B. 37,5 °C 3,3 9,9 7.4 10,2 Plazma stabilitási vizsgálat 37,5 °C-on Koncentráció tin(óra) 0*g/ml) A. Humán plazma 503,00 B. Patkány plazma 502,83 C. Májhomogenizátum 50 5,50 Az összes pro-drug vizsgálatban a pro-drugra jellemző csúcs eltűnése olyan csúcs megjelenésével jár, amelynek retendós ideje közel azonos a rapamidnével. A plazma és homogenizátum-vizsgálatokat vékonyréteg-kromatográfiásan analizálva úgy tűnik, hogy kezdetben rapamicin keletkezik, ami azután egyéb bomlástermékekké alakul, mint maga a rapa-Iidein is a fenti vizsgálatokban. A találmány szerinti eljárással előállított injektálható gyógyászati készítmények hatóanyagként a rapamicin találmány szerinti eljárással előállított vízoldható származékát tartalmazzák, gyógyászatiig elfogadható hordozóanyaggal összekeverve. Hordozóanyagként vizet, vagy bármely ismert vizes alapú hordozót használhatunk, például desztillált vizet, 5 tömeg"^ dextrózt tartalmazó vizet, vagy fiziológiásán elfogadható sóoldatot, amelynek pH-ja közel semleges, például nátrium-klorid-oldatot vagy laktátos Ringer-oldatot. 1. Példa Rapamicin mono-(28)-N,N dimetil-glicin-észterének előállítása Száraz, 100 mles gömblombikba 2,80 g (3,07 x 10 3 mól) rapamidnt, 0,616 g (5,98 x 10'” mól) N,N-dimetil-glieint és 1,40 g (6,80 x 10'3 mól) didklohexil-karbodiimidet mérünk. A lombikban nitrogénatmoszférát biztosítunk, és 60 ml vízmentes (foszfor-pentoxid felett szárított) metilén-kloridot, majd 60 mg 4-(dímetlI-amino)-pirídint adunk az elegyhez. A reakdóelegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük. A reakdóelegyből vett minta vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálata szerint (futtatás: aceton és metilén-klorid 1:1 térfogatarányú elegyével) a reakció befejeződött. A monoglidnát-észter Rr értéke 0,32. Kevés digllcinát-észtert is találtunk, amelynek Rr értéke 0,09. A reakdoelegy feldolgozására először leszűrjük a diciklohexil-karbamidot (DCU-t). Az oldószert rotációs vákuumbepárlóval eltávolítva fehér, szilárd maradékot kapunk. A nyersterméket 18 g szilikagélen kromatografáljuk, és a rapamidnt, valamint a maradék DCU-t 300 ml etil-aceáttal eluáljuk. A cím szerint terméket metilén-klorid és aceton 1:1 térfogatarányú elegyével eluálva 1,67 g terméket kapunk, a hozam 55%. A terméket nehéz kristályosítani. NMR-spektruma (300 MHz, CDCI3 oldószer) alapján a pro-drug spektruma azonos a rapamicinével, azzal az eltéréssel, hogy a glicinátcsoportból két szingulett jelenik meg. Az N.N-dimetil-csoport protonjai 52,32 ppm-nél szingulettként jelennek meg. A glicinát metiléncsoportja 53,16 ppm-nél (s) található. 2. példa Rapamidn-mono-(28)-N,N-dimetlI-glicinát-metán-szulfonsavas só előállítása 100 ml-es száraz gömblombikba 3,00 g (3,10 x 10'3 mól) rapamidn-mono(N,N-dimetil-gUdnát)ot mérünk. Az anyagot 15- ml vízmentes, foszfor-pentoxidról desztillált metilén-kloridban oldjuk. Az oldathoz 2,71 x 10'3 mól/1 koncentrádójú dletil-éteres metánszulfonsav törzsoldatot adunk. Az oldószert azonnal eltávolítva 3,25 g fehér, szilárd anyagot kapunk, a hozam 99%. A kapott vegyületet is nehéz átkristályosítani. A vegyület só formája hosszú keverési idő esetén instabil. Még a kristályos forma is lassan elszíneződik, ha hosszabb ideig fény éri. A cím szerinti vegyület je nemzőit az alábbiakban ismertetjük. Fizikai tulajdonságok Molekulatömeg: 1095 Olvadáspont: 93 -99 °C ‘>8.05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
