197945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új peptid antibiotikumok és ilyen hatóanyagot tartalmazó készítmények előállítására
197945 A BU-2867T antibiotikumok Pseudomonas-aciláz enzimmel történő lebontása díján más lebontási termékeket kapunk, mint a fentebb leírt, ficinnel vagy papainnal lefolytatott hidrolízis esetén. A Pseudomonas Pa-129 törzset 10 liter 2% oldható keményítőt, 0,2% glükózt, 3% szójalisztet, 1% kalcium-karbonátot és 0,3% magnézium-szulfát-heptahidrátot tartalmazó tápközegben 37°C hőmérsékleten 3 napig szaporítjuk, majd a sejteket centrifugálással elkülönítjük. Az elkülönített sejteket 1 — 1 liter nátrium-klorid-oldattal kétszer mossuk, majd 0,75 liter nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk őket. Ezt a sejt-szuszpenziót 1,5 liter vízzel készített, 75 g nátrium-alginátot és 75 g karboxi-metil-cellulózt tartalmazó, autoklávban sterilizált szuszpenzióval keverjük, majd a kapott elegyet keverés közben leöntjük 30 liter 0,1 mólos kalcium-klorid-oldatba. A sejtekbe zárt gélt 25%-os glutár-aldehid-oldattal való keverés útján merevítjük és egy 4,0X175 cm méretű oszlopba töltjük. Ezen az oszlopon 1,5 g BU-2867T A 30 liter 20%-os vizes metanollal készített oldatát vezetjük át óránként 0,4—0,8 liter áramlási sebességgel. Az oszlopról távozó folyadékot azután egy 300 ml Amberlite IRC-50 gyantát (70% NH4+ alakban, pH=6,7) tartalmazó oszlopon, majd ezt követően egy 300 ml HP-20 gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük át. Az IRC-50 oszlopot vízzel mossuk, majd 1,5 n ammónium-hidroxi-oldattal eluáljuk. A ninhidrinnel pozitív reakciót mutató frakciókat egyesítjük, bepároljuk és a maradékot liofilizáljuk. Ily módon 800 mg halványsárga szilárd terméket kapunk, amelyet egy 250 ml szilícium-dioxidot (C,8) tartalmazó fordított fázisú oszlopra viszünk. Az oszlopot közepes nyomás alatt vízzel eluáljuk, a ninhidrinnel pozitív reakciót mutató eluátumokat egyesítjük és bepároljuk. 612 mg (XI) képletű L-treonil-ciklikus amint (az elméleti hozam 62%-a) kapunk; op.: 170°C; [a]£7=157° (c=0,5, H20) EI-MT: m/z 342 (M+). UV: vég-abszorpció. IR (KBr): vma*=3350, 3280, 1650, 1620, 1530 stb. cm^‘ 'H-NMR (80 MHz, DMSO-d6): 6=1,05 (3H, d), 1,21 (3H, d), 1,4—2,2 (4H), 4,35 (2H, m), 4,47 (1H, m, OH), 4,62 (1H, d, OH), 6,16 (1H, d), 6,42 (1H, dd), 7,36 (1H, t, NH), 8,62 (1H, d, NH). A HP-20 oszlopot 1 liter vízzel eluáljuk, majd az eluálást 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat és metanol 1:2 arányú elegyével folytatjuk. Az (V) képletű 2,4-dodekadiénsavat tartalmazó frakciókat egyesítjük, 300 ml térfogatra bepároljuk, majd 2,0 pH-értékre savanyítjuk. Ezt az oldatot azután 300 ml etil-acetáttal, majd 100 ml n-butanollal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonat bepárlása útján olajos maradékot kapunk, ezt 800 ml Sephadex LH-20 oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot metanollal eluáljuk és az eluátumokat a 260 nm-nél mutatott UV abszorpció alapján vizsgáljuk. A kívánt terméket tartalmazó 15 eluátumokat egyesítjük és bepároljuk; maradékként 259 mg tiszta (V) képletű vegyületet kapunk színtelen lemezes kristályok alakjában; hozam: 53%; op.: 48—49°C. UV: Kmax (CH3OH) nm (e)=258 (24 000). IR (KBr): vma,= 1680, 1630, 1605, 1410, 1300 cm'1 ‘H-NMR (80 MHz, CD3OD): 6=0,89 (3H, t) 2,0 (IOH), 2,12 (2H, m) 5,75 (1H, d), 6,16 (2H, m), 7,21 (1H, m). A vegyület azonos a BU-2867T A antibiotikum savas hidrolízise utján kapott 2,4-dodekadiénsavval. Az n-butanolos kivonat vákuumban történő bepárlása és a maradék liofiiizálása útján 160 mg BU- 2867T A kiindulási anyagot (11%) nyerünk vissza. A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy a (VIII) és (IX) képletű vegyületek előnyös kiiidulási anyagok a találmány szerinti új antibiotikumok előállítására. A szokásos acilezési műveletek, például a karbonsav és valamely szénsav-alkilészter (HOCOOR) vegyíts anhidridjével való reagáltatás útján a kívánt peptidkötés könnyen kialakítható; vö.: Advanced Organic Chemistry, Fieser, 1039— 10‘6.old., Reinhold Publishing Corporation, Ne# York, 1965. A hidroxilcsoportok a szokásos módon, például tetrahidropiranil- vagy tere-butil-észter képzése útján védhetők az acfezési reakció során. A (VIII) képletű vegyidet aminocsoportjának a (XII), (XIII) illetőleg (XIV) karbonsavakkal való acilezése útján a BU-2867T A, BU-2867/ B illetőleg BU-2867T C antibiotikumhoz jutunk. így például a BU-2867T A antibiotikum a (VII) képletű karbonsav és a (VIII) képletű ciklikus am n, vagy az (V) képletű karbonsav és a (XI) képletű vegyület kapcsolása útján állítható elő, amint ezt az alábbi 2. és 3. példa szemlélteti. 2. példa 15 mg (VII) képletű vegyület, 10 mg N,N’-dic iklohexil-karbodiimid és 8 mg 1 hidroxi-1,2,3-benzotriazol elegyét 2 ml dimetil-formam dban szobahőmérsékleten 2 óra hosszat keverjük, majd 10 mg (VIII) képletű vegyületet adunk hozzá és a keverést éjjelen át folytatjuk. A kapott oldatot bepároljuk és a maradékot fordított fázisú szilícium-dioxid (C18, 40 ml) oszlopon kromatografáljuk, 80%-os metanollal eluálva. A kívánt terméket tartalmazó eluátumokat egyesítjük és bepároljuk, a maradékot preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiával (oszlop: SSD-ODS -842, mobil fázis: 90%-os vizes metanol) tiszti tj 1 k. Az aktív frakció bepárlása utján 7,4 mg BU 2867T A antibiotikumot (az elméleti hozam 28%-a) kapunk; a termék minden tekintetben azonos a természetes antibiotikummal. vékonyréteg-kromatográfiai vizsgálat/sziláncs, C2H5OH : H20=55:45/: R,=0,45. Nagynyomású folyadékkromatográfiai vizsgálat (Lichrosorb RP-18, C2H5OH : H20= =65:35/: Rt=6,43 perc. 16 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
