197943. lajstromszámú szabadalom • Eljárás optikailag aktív alfa-aril-alkánsavak előállítására biotechnológiai úton
197943 Az enzimet különféle szubsztráthoz kötött állapotban is használhatjuk, a szubsztrátot önmagában ismert módon választhatjuk meg. A találmány szerinti eljárást 10 és 60°C közötti hőmérsékleten folytathatjuk le, előnyö sen 20 és 40ÖC közötti hőmérsékleten dolgozzunk, míg a reakcióelegy pH-értékét 5 és 9 között tartjuk, előnyösen 6 és 8 közötti pH-értéket biztosítunk, az enzim az utóbbi pH-érték közelében mutat legnagyobb aktivitást. A reakcióelegy pH-ját vagy pufferoldattal tartjuk állandó értéken, vagy a reakció során felszabadult savat bázissal — például kálium-hidroxiddal, nátrium-hidroxiddal, stb. — semlegesítjük. A reakcióelegyben a kiindulási anyagként használt racém észterek koncentrációja 1 és 20 tömeg% között változhat. Az aszimmetrikus hidrolízis reakcióideje 5 és 64 óra között lehet, az alkalmazott enzim fajlagos aktivitásától függően, amely általában az enzim tisztasági fokától függ. Az aszimmetrikus hidrolízis reakció befejeztével a reakcióelegyből extrahálhatjuk az S(-(-)-izomerben gazdag savat, és a reagálatlan, R (—)-izomerben gazdag észtert. Az extrahálást vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel — például metilén-kloriddal, toluollal, ligroinnal, etil-éterrel vagy egyéb hasonló oldószerrel — végezhetjük. Az így kapott szerves extraktumból koncentrálás után elválaszthatjuk a főleg S(-(-)-izomer formájában lévő savat a főleg R( — )-izomer formájában lévő észtertől, oly módon, hogy az extraktumot kromatográfiás oszlopon vezetjük keresztül, amelyben álló fázisként például szilikagélt használunk. Az S( + )-enantiomerben gazdag savat úgy is elválaszthatjuk a reakcióelegyből, hogy a reakcióelegyet bázissal — például 5%-os vizes nátrium-hidroxid-oldattal vagy 10%-os vizes kálium-hidroxid-oldattal — extraháljuk. Az R( — )-enantiomerben gazdag, hidrolizálatlan észtert — melyet a fenti módon választottunk el — ezután racemizálhatjuk, például vízmentes közegben bázissal kezelve, majd a találmány szerinti eljárásban újra felhasználhatjuk, mint kiindulási anyagot, azaz újra alávethetjük az enzimatikus aszimmetrikus hidrolízisnek. Bonyolultabb, és általában kevésbé célszerű módon úgy is eljárhatunk, hogy a fenti R(—)-észtert R(—)-savvá hidrolizáljuk, majd a savat racemizáljuk, és újra észterezzük, végül a kapott R,S-racém észtert vezetjük vissza a találmány szerinti eljárás kiindulási anyagaként a folyamatba. A találmányt közelebbről — a korlátozás szándéka nélkül — az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. 1. példa S( + )-2-(4-izobutil-fenil)-propionsav előállítása 100 ml 0,2 mól/1 koncentrációjú nátrium-hidrogén-f oszf át-k ál ium-dihidrogén-foszfát 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65 4 pufferoldathoz (pH 7) 2,92 g (R,'S)-2(4-izobutil-fenil)-propionsav-etoxi-karbonil-metil-észtert és 400 mg, Candida cylindracea mikroorganizmusból nyert lipáz enzimet (gyártja a SIGMA Chemical Co., USA, 30% protein-tartalom, aktivitása 1400—2800 egység/mg protein) adunk. A reakcióelegyet 24 órán át 28°C-on intenziven keverjük. Az elegyet ezután metilén-kloriddal extraháljuk. Az extraktumot nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással analizáljuk (Erbasil RP-18, CH3CN/H20 75/25, 254 nm, UV-detektálás) és az átalakulás mértékét a képződött sav és az átalakulatlan észter csúcsainak arányából számítjuk ki. A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint az átalakulás mértéke 45%, ami az S(+)-forma 90%-os hidrolízisének felel meg. Az extraktumot koncentráljuk és oszlopkromatográfiás eljárással tisztítjuk, álló fázisként szilikagált, és eluensként hexán és éter 3:1 arányú elegyét használva. A sav szerkezetét NMR-analízissel bizonyítjuk. A kapott cím szerinti szilárd termék olvadáspontja 49°C, optikai forgatóképessége [a]o =+55,55° (c= 1, etanol). A gáz-folyadék-kromatográfiás analízis szerint a termék, mint S(—) -a-metil-benzamid-származék optikai tisztasága ^ 95%. 2. példa 100 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú kálium-klorid-oldathoz 2,4 g (R,S)-2-(4-izobutil-fenil)-propionsav-propargil-észtert és 400 mg, Candida cylindraceából nyert lipáz enzimet adunk, amelynek jellemzőit az 1. példában ismertettük. A reakcióelegyet 37°C-on intenzíven keverjük, miközben a pH-értéket 0,5 mól/1 koncentrációjú kálium-hidroxid-oldat adagolásával 6,8 értéken tartjuk. 48 óra elteltével a vizes kálium-hidroxid-oldat fogyásából számítva az átalakulás közel 40%-os, az S( + )-2-(4-izobutil-fenil)-propionsavra nézve. A termék elválasztását és vizsgálatát az 1. példában ismertetett módon végezzük. A kapott szilárd termék optikai forgatóképessége [a]o° = +54,9° (c=l, etanol), olvadáspontja 49°C. 3. példa 500 ml-es lombikba 100 ml tápfolyadékot helyezünk, amelynek összetétele: 10 g glükóz, 5 g pepton, 3 g malátakivonat és 2 g élesztőkivonat, 1000 ml vízben oldva, pH-ját 6,8-ra állítjuk. A tápfolyadékot sterilizáljuk, majd leoltjuk a Candida cylindracea ATCC 14830 ferde agárról vett tenyészetével, és 30°C-on 52 órán át tenyésztjük, 350 fordulat/perc sebességgel mozgó' rotációs rázógépen. A tenyészet pH-ját 0,5 mól/1 koncentrációjú vizes kálium-hidroxid-oldattal 7-re állít3
