197941. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A42125 jelű antibiotikum előállítására
197941 dextrin, bár más cukrok, cukor-polimerek, stb. is használhatók. A N.aerocolonigenes előnyös nitrogénforrása a szójaliszt és a kukoricalekvár, de más nitrogénforrás, például desztillációs maradékok, élesztőkivonat, húskivonat, stb. is alkalmazható. A táptalajban felhasználható szervetlen tápsók a cink-, nátrium-, magnézium-, kálcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát-, stb. ionokat szolgáltató, vízoldékony sók. Ugyancsak tartalmazza a táptalaj a mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges elengedhetetlen nyomelemeket. Ezek a nyomelemek a táptalaj komponenseiben szennyezésként általában a növekedéshez szükséges mennyiségben előfodulnak. A habzás általában nem szokott problémát okozni, de nagyméretű fermentálásnál, ha szükséges, a tenyészethez hozzáadhatunk kevés (pl. 0,2 ml/liter) habzásgátlót, például polipropi lén-gl ikolt. Nagy mennyiségű A42125 antibiotikum előállításához tank-fermentorban végzett, süllyesztett, aerob fermentációt előnyös végezni. Kis mennyiségű A42125 antibiotikumot rázott lombikos tenyészetben is készíthetünk. Amennyiben a nagy fermentort spórákkal oltjuk be, számolni kell a lag-fázissal, ezért előnyösebb vegetatív oltóanyagot használni az oltáshoz. A vegetatív oltóanyag előállításához kis térfogatú táptalajt spórákkal vagy micélium fragmensekkel oltunk be, így friss, aktívan növekvő tenyészethez jutunk. Ezt a vegetatív oltóanyagot visszük át a nagy fermentorba. A vegetatív oltóanyag tápközege megegyezik a nagy fermentoréval, 'da lehet attól eltérő is. A Nocardia aerocolonigenes 25—37°C hőmérséklettartományban termeli az A42125 antibiotikumot. Az antibiotikumtermeléshez optimális hőmérséklet a 30°C. Amint az a süllyesztett tenyészeteknél szokásos, a fermentor aljáról steril levegőt nyomunk keresztül a táptalajon, miközben lapátos keverővei kevertetünk. Az eddig alkalmazott körülmények között a maximális oxigénfelvétel nem haladja túl a 0,2 mmólt literenként és percenként. Egy terelőkkel ellátott, 115 liter táptalajt tartalmazó, 160 literes fermentornál percenként 200—250 fordulatszámú keverés mellett percenként 0,125 térfogatnyi levegőt kell átvezetni, hogy az oldott oxigén elérje vagy meghaladja a levegőtelítettség 30%-át. A fermentálás folyamán vett mintákban az A42125 antibiotikum termelését biológiai értékméréssei határozzuk meg az antibiotikumra érzékeny ismert mikroorganizmus segítségével. Az egyik ilyen teszt-mikroorganizmus segítségével. Az egyik ilyen teszt-mikroorganizmus a Micrococcus luteus. A biológiai értékmérésre legalkalmasabb a lyukasztott agarlemezes eljárást használni. 15 Az A42125 antibiotikumot a fermentációs iparban alkalmazott eljárásokkal nyerhetjük ki a tenyészléből. A termelt antibiotikum főként a fermentlé folyékony fázisában található. Az A42125 antibiotikum maximális kinyeréséhez ezért először a fermentlé folyékony fázisát elválasztjuk a micélium tömegétől. A fermentlészűrletet aztán tisztíthatjuk az antibiotikum elválasztása céljából. Erre számos eljárást alkalmazhatunk. Az A42125 antibiotikum elválasztására előnyös eljárás, hogy a szürlet kémhatását pH=7-re állítjuk be és alkalmas adszorbenst, például Diaion HP-20 gyantát adunk hozzá. A gyantát szűréssel elválasztjuk és megfelelő oldószerrel, például acetonitril/víz, 1:1 eleggyel extraháljuk. Az extraktumból az oldószert csökkentett nyomáson elpárolva, hozzájutunk az A42125 antibiotikumhoz. Az így kapott A42125 antibiotikumot ismert módszerekkel tovább tisztíthatjuk. Előnyös eljárás erre az ioncserélő gyantákon végzett kromatografálás. Az A42125 antibiotikus elválasztást vékonyréteg kromatográfiával követjük nyomon. A szílikagélréteg alkalmas futtató rendszere az acetonit ril/metanol/víz/ammonium -hid - roxid, 4:2:2:1 összetételű elegy. Ebben a rendszerben az A42125 antibiotikum kb. fy=0,43 értékkel mozdul el. Az antibiotikum kimutatására használhatunk bioautográfiát, például Micrococcus luteust használva erre a célra, vagy más módszert például vanilines kénsavas előhivóreagenst. Eljárhatunk úgy is, hogy A42125 antibiotikumforrásként a fermentlé, micéliumot is tartalmazó szárazanyag tartalmát használjuk fel extrakció és elválasztás nélkül, de előnyösen a víz eltávolítása után. így például az antibiotikum megtermelése után, a teljes fermentlevet beszárítjuk fagyasztva szárítással, dobszűréssel vagy azeotropos desztilIálássa 1 és szárítással. A beszárított fermentlevet közvetlenül hozzákeverjük a takarmány premixhez. Az A42125 antibiotikum állati és növényi patogén baktériumok növekedését gátolja. Az V. táblázatban összefoglaltuk a különféle baktériumoknál kapott minimális gátlási koncentrációkat (MIC). A MIC értéket a szokásos agar-hígításos vizsgálattal határoztuk meg. V. TÁBLÁZAT Az A42125 antibakteriális aktivitása 16 Vizsgálati mikroorganizmus MIC (mcl/ml) Staphylococcus aureus VI.1 1 Staphylococcus aureus V41 I Staphylococcus aureus X400 1 Staphylococcus aureus S13E 1 Staphylococcus epidermidis Epi 1 1 Staphylococcus epidermidis 222 0,5 Streptococcus pyogenes C203 2 Streptococcus sp. group D X66 1 St-eptococcus sp. group D 2041 4 Haemophilis influenzae 76 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
