197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 — egy hőmérsékletre érzékeny cl génnel rendelkeznek; — működő N, Q, S és R génjeik vannak, melyek restriktiv körülmények között fejezik ki az endolizint; valamint — szelekciós markért tartalmaznak, nevezetesen a tnlO tetraciklinnel szembeni rezisztenciát átvivő elemet. Az ilyen hibás lizogének 4 egymástól független csoportot alkotnak a vírus (fág) szaporítása szempontjából: i) hiányzik a O é| P replikáló funkció; ii) hiányzik az att, mely miatt lehetetlenné válik a profág számára, hogy egy felülfertőző fágból int és xis génekkel egészüljön ki; iii) nem képes arra, hogy a lambda szerkezeti géneket kódolja; valamint iv) a lambda DNS mérete messze a védőburok képzéséhez szükséges minimális méret alatt marad. _ Ilyen hibás lizogéneket először úgy állíthatunk elő, hogy cI857, 0~, P8 lizogén törzseket — mint például az MG törzseket — kloráttal kezeljük, hogy kloráttal szemben rezisztens mutánsokat kapjunk, majd az ilyen mutánsok közül kiválasztjuk azokat, melyek nem képesek kiegészülni a felülfertőző heteroimmunis vagy virulens lambda fággal vagy az A és B funkcióban hiányos lambdoid fággal történő szaporítás során. A markért tartalmazó DNS fragmenst, a lambda DNS-t és az E. coli kromoszómájából származó szomszédos szekvenciát izolálhatjuk az MG4 törzstől restrikciós endonukleáz enzimes kezeléssel vagy Pl transzdukcióval. Az MG4 baktérium törzset az MG3 törzsből származtathatjuk úgy, hogy delécióval eltávolítjuk az összes bakteriofág gént — vagy legalább is azok nagy részét —, melyek a vírus szerkezeti komponenseket kódolják. Annak érdekében, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy ezek a gének kiestek, elegendő kimutatni, hogy az MG4-ben a vírus (fág) genom képtelen arra, hogy az e géneket nem tartalmazó felülfertőző fágot kiegészítse és szaporítsa. A X charon 3A (X A-, R_ imm08O) egy olyan fág, mely alkalmas erre a felülfertőzésre. Ugyanúgy bármely olyan fág, mely az A, B vagy más szerkezeti cisztronjában amber mutációt hordoz, kimutatható az érzékeny E. coli baktériumon egy heteroimmunis vagy virulens fág (lambda vírus) jelenlétében. A két ’fág között rekombináció lép fel és egy rekombináns, például virA~ keletkezik. A kísérlet körülményeitől függően a rekombináció gyakorisága 1—50% között lesz. A rekombináns fágokat felismerhetjük arról, hogy a szupresszort tartalmazó lizogén baktériumokon [Y mel(/.)] tenyészthetők, és hogy a szupresszort nem tartalmazó lambda érzékeny baktérium törzseken — mint például az N99 törzsön — nem képesek plakkokat létrehozni. A fenti keresztezéssel kapott plakkokat Y mel(/.) vagy N99 törzset 11 tartalmazó Petri-csészékben tenyésztjük, és a rekombinánsokat tisztítjuk. Előnyösen A és/vagy B gén funkció hiányos lambda fágokat használunk, mivel az MG4 lambda genomban való elhelyezkedésük miatt, amely genom nem képes a fenti működés helyettesítésére, az összes többi lambda szerkezeti génjük is hiányos. A hibás fágok. és gazdasejtek ehhez hasonló alkalmazási módja, amelyet „marker mentéseként említenek, széles körben elterjedt, erre találunk példát a Hershey által kiadott „The Bacteriophage Lambda" c. munkájában (Cold Spring Harbor Laboratory, 1971. — elsősorban Stevens és társai által írt részben. 515—553. old.). A találmány szerint bármely baktérium-termék előállítható. Példaként említhetjük, többek között az inzulint, veszettség elleni glikoproteint, K99 987P antigént, antibiotikumokat, növekedésszabályozó hormonokat, metallothionineket, a-l-antitripszint, influenza elleni antigéneket, limfokineket és interferont. Emellett a találmány alkalmazható baktérium kolóniák átvizsgálására, RNS izolálására és plazmid előállítására, mivel a találmány az egyébként szükséges lízis folyamatának a mellőzésével nagymértékben egyszerűsíti ezeket az eljárásokat és lerövidíti az eljárások lefolytatásához szükséges időt. A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. Az alábbi példákban szereplő kiindulási anyagok könnyen hozzáférhetők vagy ismert eljárásokkal könnyen előállíthatok. E coli C600: ATCC 23724 E coli N99: ATCC 33956 E coli MM 294: ATCC 33925 E coli N5151: a Gottesman és munkatársai által a J. Mól. Bioi. 140, 57—75 (1980) helyen ismertetett SA500 törzsből vezethető le, amelyet cI857 hőmérsékletérzékeny X represszort hordozó X fággal fertőzünk. Ez a gén a pRK248dts plazmidban, a JMB9 törzsben (ATCC 33766) hozzáférhető. Az SA500/X lizogén előállítható az A. D. Hershey, The Bacteriophage Lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1971 vagy a Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982. helyen ismertetett módon. E coli AR4: az N4903 törzs (Gottesman id. h.) /.-érzékeny rekombinánsa, amelyet PlcmIOO segítő fággal fertőzünk. A PlcmlOO egy transzdukáló fág, szokásosan alkalmazott eszköz baktérium DNS egyik sejtből a másikba történő átvitelére (1. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). A PlcmlOO a Pl transzdukáló fágból vezethető le, amely az ATCC 25404-B1 számon hozzáférhető, meg van említve Hershey idézett helyen és Glass, Gene Function E. coli and its Heritable Elements, University of California Press, Los Angeles, 1982. helyen. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
