197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 Fágok genetikai manipulációjára számos módszer ismeretes, így például Hendrix és munkatársai, Lambda II, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982, vagy Hershey Miller, Maniatis vagy Glass idézett művei. A k fág mutációk szintén ismert módszerekkel végezhetők, így a következőkkel: A.cI857 — Sussman, C.R.H. Acad. Sei., Paris, 254, 517—19 (1962); P3; 029; P80 — Campbell, Virology, 14, 22—32 (1966); in16; red3 — Signer, J. Mól. Bioi. 32, 261 (1968); hy5; Ab2— Gottesman, J. Mól. Bioi. 31, 487—505 (1968); és Liedke— Kulke, Virology, 32, 465 (1967); imm21 — Herskowitz, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 35, 355 (1970). 21 fág: egy, a k tággal rokon lambdoid-szerű bakteriofág (1. Hendrix, id. h.) a korábban AJággal fertőzött sejtek fertőzésére használható. Emellett a k/21 hibridek (1. Gottesman és Liedke—Kulke id. h.) olyan sejtek íelülfertőzésére használhatók, amelyek a A,fág fertőzéssel szemben immunissá válnak. pDN5 plazmid: a pBR322 származéka, 4 tandem lac promotort tartalmaz, amelyek operatíven kapcsolódnak az LT gén B alegységéhez (1. Miller, Vaccine 85: CSH Molecular Approaches to Vaccines, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1985). pESS2 plazmid: az LT gén B alegységét pDM101-be klónozva tartalmazza, amely egy másik pBR322 származék, amely tartalmazza a par helyet. (Meacock, Cell, 20, 529—42 (1980)]. A klónozás előtt az LT gént izoláljuk és szubklónozzuk a pBR322 BamHI helyére, így előállítva az RSF2124 plazmidot (1. So és munkatársai, Infect. Immun., 21, 405—411 (1978)). A találmány szerinti megoldásokban a transzdukciókat a J. H. Miller, „Experiments in Molecular Genetics" [Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1972.) 201 — 205] című kiadványban ismertetett módon végeztük. 1. Példa MGO baktérium törzs előállítása C600 baktériumtörzset (ATCC 23724) (E. coli SuII+ galK LasZ suli thi) a A,cI857 P3 029 (W. Syzbaleski, Wisconsin Egyetem ajándéka) fág jelenlétében inkubáltuk. Egész éjszakán át 32°C hőmérsékleten hagytuk a tenyészetet növekedni, majd az életben maradt baktériumokat izoláltuk és tisztítottuk. E baktériumok 80%-a immunisnak bizonyult a felü 1 fertőzéssel szemben, nem tudott 44°C-on továbbfejlődni, és 44°C-on való kezelés után lambda fágokat termelni, mely a A,cI857 P 3 029 fágtól megkülönböztethetetlen volt [melyet igazol, hogy e fágok képesek plakkokat képezni a C600 baktérium törzsön, azonban N99 (E. coli K12 galK lacZ suO thi) baktérium törzsön nem]. Az életbenmaradt bak- 8 13 tériumok egy részét megtisztítottuk és MGO törzsnek [C600 (A.cI857 P3 029)] neveztük el. 2. Példa MGO-AR6 baktériumtörzs előállítása Az N5151 [E. coli K12 SA500 galK lacZ pro thr his gal8 (>. cI857 A58—71 AH1)] baktériumtörzset az AR4 [E. coli K12 gal::tnl0 (PlcmlOO)] baktériumtörzsön tenyésztett PlcmlOO fág jelenlétében inkubáltunk. Az N5151 baktérium és az AR4 baktériumon tenyésztett PlcmlOO fág közötti keresztezés tetraciklinnel szemben rezisztens, ultraibolya sugárzással és hőmérséklettel szemben érzékeny lizogén baktériumokat eredményezett. Az izolált baktériumok közül egyet megtisztítottunk és MGO-AR6-nak [E. coli K12 ga!8 gal::tnl0 k A 58—71 cI857 A Hl (bio uvrB)] neveztük el. 3. Példa MG1 baktériumtörzs előállítása Az MGO-AR6 baktériumtörzset PlcmlOO lizogénné tettük úgy, hogy az AR6 baktériumokat PlcmlOO fág jelenlétében inkubáltuk, és az életbenmaradt baktériumokat izoláltuk. A PlcmlOO lizogén MGO -AR6 baktériumokat MGO-AR18 törzsnek neveztük el. Az MGO baktériumtörzset az MGO-AR18 baktériumtörzsön tenyésztett PlcmlOO fággal kereszteztük Pl transzdukció révén. Elég időt hagyva, hogy a baktériumok abszorbeálják a fágokat, a baktériumokat 4 J/m2 erősségű ultraibolya sugárzásnak vetettük alá (az ultraibolya sugárzásmérő szerint a 254 nm fény sugárzása 2 J/m2 erősségű volt), és tetraciklin jelenlétében inkubáltuk. A tetraciklinnel szemben rezisztens kolóniák 11 %-a volt rezisztens az ultraibolya sugárzással szemben, jelezve, hogy nem hordozzák a Hl deléciót, így tehát a lambda géneket a cl-től a fág jobboldali végéig terjedően tartalmazzák. Pontosabban ez azt jelenti, hogy e kiónok hordozzák a P3 és 029 mutációkat, valamint érintetlen S és R géneket. Az ultraibolya sugárzással és tetraciklinnel szemben rezisztens baktériumsejtek egyharmada nem volt képes fágot termelni. Ennélfogva úgy véljük, hogy ezeknél a lambda DNS 58—71. helye szerinti gének delécióval kiestek, tehát elvesztették az ind, xis és kil géneket. Ezt a csoportot tisztítottuk és MG 1 (C600) [(XA58- 71 cI857 P3 029) SuII+ galK lacZ thi gal::tnl0 tét ) ] törzsnek neveztük el. 4. Példa MG3 baktériumtörzs előállítása Az MG1 baktériumtörzset a PlcmlOO fág jelenlétében inkubáltuk és az életbenmaradt baktériumokat tisztítottuk. Az életbenmaradt baktériumok között nagy százalékban voltak olyan MG1 baktériumsejtek, melyek PlcmlOO lizogénné váltak. A PlcmlOO lizo-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
