197940. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-termékek előállítására transzformált baktériumok segítségével
197940 zött. Az O és a P mutációk lehetnek delécióval létrejött mutációk vagy pontmutációk. A pontmutációk — mint például a 029, P3 és a P80 mutációk — előnyösebbek, mivel könnyebben hozzáférhetők. A P3 mutáció előnyösebb, mint a p80 mutáció. Egy másik speciális esetben a fragmens olyan lambda DNS-t tartalmaz, mely lényegében delécióval elveszítette a kromoszómatérkép 3. és 71. helye közötti génjeit. Az ilyen DNS fragmensből lényegében véve hiányzik minden gén, mely fontos a lambda fág kapszidburkának a létrehozásában, továbbá hiányzik belőle az int, xis és kil gén is. Az E. coli vagy más egyéb baktériumsejt, mely elő tudja állítani a kívánt terméket, vagy amelyet már korábban vagy a későbbiek során — például génmanipuláció révén — képessé tettünk a termék előállítására, ismert módon transzformálható olyan fág DNS szekvenciával, amely egy hőmérsékletre érzékeny fág represszor gént és a fág lizozim enzim termelését kódoló géneket hordoz. Ilyen eljárás például a baktérium megfertőzése egy olyan mérsékelt fertőzőképességű fággal — előnyösen hibás fággal—, mely tartalmaz ilyen hőmérséklettel szemben érzékeny represszor gént. Továbbá ilyen eljárás a baktérium ismert módon történő transzformálása a találmány szerinti DNS fragmenssel például transzformálás, transzdukció, konjugáció vagy fúzió útján. A transzformáció általában magában foglalja a fragmens bevitelét egy vektorba, például fágba vagy plazmidba. Például a fragmenst klónozással bevihetjük egy plazmidba (például a pBR322 vagy más plazmidba) és in vivo szaporíthatjuk egy olyan megfelelő gazdasejtben, melyből hiányzik a fragmenssel szomszédos szekvenciáknak megfelelő - homológ szomszédos szekvencia vagy amelynek rekombinációs elemei hiányosak (rec-). A plazmidot kinyerhetjük és alkalmas gazdasejtet transzformálhatunk vele a termék előállítása céljából. Az ilyen gazdasejt a transzformálást követően az olyan fragmens, mely a gazdasejt kromoszómájában lévő szomszédos DNS szekvenciával homológ szomszédos DNS szekvenciával rendelkezik, spontán rekombináció útján beépül a homológ szomszédos szekvencia helyére. Más módon úgy is eljárhatunk, hogy a kívánt termék szempontjából megfelelő gazdasejtet transzformáljuk a lineáris vagy ciklikus formában izolált DNS fragmenssel. A DNS fragmens egy szelekciós markértis tartalmaz, mely segít abban, hogy kiválaszthassuk a transzformánsokat. A szelektálást lehetővé tevő markerek olyan gének, melyek kimutatható enzimek termelését kódolják, amelyek az auxotróf gazdasejt prototrófiáját helyreállítják vagy rezisztenssé teszik a baktériumot letális vagy gátló vegyületekkel — rendszerint antibiotikumokkal — szemben. Előnyös, ha a szelekciós marker egy olyan gén, mely antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosít, mert ehhez nem 6 9 szükséges auxotróf gazdasejt, amely esetleg nem áll rendelkezésre vagy amely spontán módon visszaalakulhat prototróffá. Előnyös a tetraciklinnel szembeni rezisztencia, mert a tetraciklin olcsó és a vele szembeni rezisztencia normális körülmények között spontán módon nem alakul ki. A transzformálásban jelen lévő szelekciós marker jelzi, hogy a gazdasejt tartalmazza a DNS fragmenst. A DNS fragmens beépülése esetén az egész fragmens beépül, mivel a DNS fragmens és a gazdasejt DNS-e közötti homológia csak a lambda DNS és a markerrel szomszédos tartományban áll fenn. Ha a DNS fragmensben nincs marker, akkor a lambda DNS-t hordozó gazdasejt transzdukció utáni szelekciója vagy más transzformáló eljárás további eljárást igényel, amelynek során a feltételezhetően transzdukált sejteket meg kell fertőzni (szuperinfekció) egy hibás fággal (mely nem integrálódik), és az immunis túlélő baktériumokat ki kell választani. A találmány szerinti DNS fragmens integrálása révén litikussá tett E. coli törzsként például MG törzseket használhatunk. E törzsek olyan lizogének, melyekből a kromoszómatérkép 58. és 71. helye közötti lambda fág DNS rész delécióval kiesett, ennélfogva hiányzik az int, xis, red, gam, kil és clII gén; rendelkezik cI857 mutációval; van O és P gén mutációja; működő N, Q, S és R génjei vannak, melyek révén restriktiv körülmények között történik az endolizin kifejezése. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, az MG1 baktérium törzsnél [C600 (XA58—71, cI857,rP3, 029, SuII+, galK, lacZ, thi, gal::tnl0 tetR], a pontmutáció (amber mutáció) végigolvasódik, és az O és P gének kifejeződnek, mivel a gazdasejt DNS-e egy amber szupresszort termel, vagyis az UAG transzlációs termináeiós kódon transzlációs szupresszorát, A találmány szerinti eljárásban előnyösebben használható fel az a gazdasejt, mely fenotípus szempontjából O- és P~ (azaz ezeket a géneket nem tartalmazza). A találmány egyik megvalósitási módja szerint az MG3 baktériumtörzs [N99 (>*A58— 71, cI857, P3, 029) galK, lacZ, thi, gah.tnlO tetR] ugyanazt a lambda DNS fragmenst hordozza, mint az MG1 törzs. AzonbanRfenotípusát tekintve 0~ és P~, valamint tér, Akii, Aint és Axis. A legelőnyösebb litikus E. coli törzsek az MG4 törzsek. Ezek olyan törzsek, amelyekből delécióval lényegében kiesett a lambda fág valamennyi szerkezeti protein- és felépítő-gén és a megfelelő profág-baktérium kapcsolódási p^nt, azaz a megfejelő illeszkedési pont (att ) kódolása. Tehát ezek a törzsek olyan lizogén baktérium törzsek, melyek delécióval elvesztették lényegében véve valamennyi, a kromoszómatérkép 3. és 71. helye között elhelyezkedő lambda génjüket; — az O és P géneknél pontmutációt tartalmaznak; 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
