197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 (2) IL-2 cDNS kifejeződése élesztőben Az IL-2 cDNS-t ki lehet fejezni élesztőben is a cDNS beiktatásával megfelelő kifejeződni képes vektorokba és a termék bevezetésével a gazdasejtbe. Különböző átvándorolni képes vektorokat, amelyek képesek kifejezni idegen géneket élesztőben, írták már le (Heitzman, R. és munkatársai: Nature, 293, 717—722 (1981) Valenzuela, P. és munkatársai: Nature, 298, 347 —350 (1982); Miyanohara és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 1—5 (1983)). A vektorok képesek replikálódni mind E. coli, mind élesztő gazdaszervezetben és ezek tartalmaznak élesztő-gén promotor szekvenciákat. Lényegileg bármely ilyen kifejeződni képes vektort lehet használni IL-2 cDNS kifejeződéséhez. Magasabb szintű IL-2 előállítást is el lehet érni élesztő alkalmazásával az állati sejtekhez vagy a baktériumokhoz viszonyítva. Itt közlünk egy példát a humán IL-2 cDNS kifejeződésére élesztőben. pAT77 és pAM82 élesztő-E. coli átvándorolni képes (“ingázó“) vektorokat írtak le Miyanohara és társai (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 1—5 (1983)). A pAM82 a pAT77-nek egy származéka és mindkettő hordoz ars 1 (Stinchcomb, D. T. és munkatársai: Nature, 282, 39—43 (1979)), 2 nmon (Broach, J. R. és munkatársai: Gene 8, 121 —133 (1979)) és leu 2 íRatzkin. B. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 474—491 (1979)) markereket, valamint az élesztő savas foszfatáz (AP-áz) génjének promotorját. Ezek hordozzák még a pBR322 egy 3,7 kb-s DNS szegmensét, amely egy ampicillin rezisztencia markert (Ap') és a replikáció kiindulópontját hordozza (8. ábra). Az AP-áz promotor indukálható a foszfát nagy koncentrációjának kicserélésével kis koncentrációra a tápközegben. Abból a célból, hogy a humán IL-2 cDNS-t kifejezzük pIL2-50A-t emésztünk Pstl-el. miután vagy E. coli Klenow-fragmenssel, vagy T4 DNS polimerázzal kezeltük, a cDNS-t összekapcsoljuk olyan pAM82-vel, amelyet előzőleg Xhol-el emésztettünk és E. coli Klenow-fragmenssel inkubáltunk, hogy a végeket kitöltsük. Hibrid plazmidokat, amelyekben a cDNS kódoló szekvencia az élesztő AP-áz promotor szekvenciától lefelé van, szelektálunk, E. cpli-ban klónozva azokat. Az így nyert plazmidot, a PYIL-2a-t élesztőbe vezetjük be, majd az AP-áz promotor indukciója után az IL-2 aktivitást az élesztő-extraktumban mérjük. A pYIL-2a plazmid tartalmaz egy GC gyök szakaszt az élesztő promotor és az IL-2 cDNS között. Lehetséges, hogy egy ilyen szekvencia gátolja az IL-2 cDNS kifejeződését. Abból a célból, hogy ezt a problémát leküzdjük, a következő plazmid megalkotását végezzük el: pIL2-50A plazmidot emésztünk Pstl-el és a cDNS inzertet izoláljuk. Ezt a cDNS-t azután T4 DNS polimerázzal kezeljük dATP, dGTP és dTTP jelenlétében úgy, hogy a C gyök szakaszai a cDNS mindkét végénél le legyenek szakítva, majd ezt követően Nuclease SÍ-el kezeljük, a 10 17 G-gyök szakaszainak eltávolítása érdekében. Ezt a DNS-t összekapcsoljuk Xhol DNS kapcsolóval és pBR 322 plazmiddal, amelynek EcoRI helyét lehasítjuk és EcoRI-val és Klenow-fragmenssel egy síkba hozzuk, és az így kapott plazmidot, a pIL2-Xho-t Xhol-el emésztjük és a cDNS inzertet izoláljuk. A cDNS-t azután bevezetjük pAM82 egyedi Xhol helyébe, és egy az élesztő AP-áz promotor szempontjából helyesen orientált IL-2 kódoló szekvenciát tartalmazó plazmidot klónozzuk E. coliban. Ezt a plazmidot, a pYIL-2b-t élesztőbe vezetjük be és az AP-áz promotor indukciója után, az IL-2 aktivitást az élesztőkivonatban mérjük. (3) A cDNS kifejeződése emlős sejtben Olyan plazmidot, amely irányítja a humán IL-2 szintézisét emlős sejtekben, a következőképpen hozhatunk létre: pCE-1 plazmidot hozunk létre pKCR-ből (O’Hare, K. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 1527— 1531 (1981)) és pBR328-ból (Soberon, X. és munkatársai: Gene, 9, 287—305 (1980)), egy sor módosítási eljárás segítségével, ahogyan ezt a 3. ábrában bemutattuk, és az IL-2 gén ATG indító szekvenciáját összekötjük az SV40 korai gén promotorjától lefelé. Ez a plazmid egy egyedi PstI helyet tartalmaz éppen az SV 40 promotortól lefelé és egy intront tartalmazó nyúl ß-globin kromoszomális gén résztől fölfelé. A plazmid szintén tartalmazza az SV 40 replikációs kezdőpontot, valamint a korai gén poliadenilációs helyet. így egy pCEIL-2 plazmidot nyerünk, amelyben az IL-2 Struktur gént át lehet írni az SV 40 korai promotor génből a megfelelő gazdasejtben (3. ábra). Ezt a plazmidot emésztjük Hhal-lal. majd DNS-átvitellel bevezetjük a COS7 transzformáit majomsejtbe, amely az SV 40 kezdőpont szekvenciát tartalmazó DNS replikációját lehetővé teszi. Fontosnak látszik a plazmid emésztése Hhal-lal az átvitel (transzfekció) előtt a cDNS hatásos kifejeződése érdekében, mivel azok a szekvenciák, amelyek akadályozzák az átvitt DNS replikációt a COS sejtekben, eltávolíthatók a cDNS kifejeződéséhez szükséges plazmid lényeges részéből ezzel a módszerrel 1—3 napos tenyészetekben (ennek a vektornak a tenyésztett COS-7 majomsejtbe átvitelétől számítva) hagyományos tenyésztési körülmények között (Gluzman, Y.: Cell, 23, 175—182 (1981)) az IL-2 általában kiválasztódik és termelődik a tenyésztett sejt tápközegében. Abból a célból, hogy a kibővített DNS-t beiktassuk més eukarióta sejtekbe, hasonló módon egy, a gazdaszervezetnek megfelelő vektort kötünk össze egy prokarióta sejtből kihasított és izolált cDNS inzerttel, és az eukarióta sejtbe átvihetünk ilyen módon szintetizált vektort és tenyészthetjük. A rekombináns DNS-t beépítő sejteket tenyésztjük vagy a rekombináns DNS sokszorozása, vagy az IL-2 polipeptid termelése érdekében. A tenyésztést hagyományos módon 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
