197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 hajthatjuk végre. így pl. a transzformált élesztőt szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen sókat és szükség esetén egyéb szerves tápanyagokat, mint pl. vitaminokat és aminosavakat tartalmazó tápközegben, 20°C—37°C közötti hőmérsékleten és 4—7 pH közti tartományban, aerob körülmények között tenyészthetjük. A transzformált prokarióta organizmusokat, mint pl. E. coli-t vagy B, subtilis-t szintén hagyományos körülmények között lehet tenyészteni. Az intracellulárisan vagy extracellulárisan termelt IL-2-t bármilyen ismert módszerrel ki lehet nyerni, úgy mint ammónium-szulfátos kicsapás, dialízis a sók eltávolítása érdekében (normál nyomáson vagy vákuumban), gélszűrés, kromatográfia, preparatív lapos ágyas izoelektromos fókuszálás, gél-elektorforézis, nagy felbontású íolyadékkromatográfia (a továbbiakban HPLC), ioncsere, gélszűrés és fordított fázisú kromatográfia és affinitás-kromatográfia festékkel kötött hordozón, IL-2 elleni monoklonális antitesttel kapcsolt aktivált Sepharose 4B-n, vagy lektínnel kötött Sepharose 4B-n, stb. Az IL-2 kinyerésének és tisztításának módszereit többen leírták (Watson és munkatársai: J. Exp. Med. 150, 849— 861 (1979), Gillis és munkatársai: J. Immunoi. Methods, 39, 185—201 (1980), és Welte, K. és munkatársai: J. Exp. Med. 156, 454—464 (1982)). Az így nyert polipeptidet azonos biokémiai és biológiai viselkedést mutat, mint az ismert IL-2, amelyet mítogénnel stimulált emlős sejttel állítottak elő, és IL-2 aktivitása is van. A molekulatömeg mintegy 15 000 dalion és az IL-2 aktivitás tökéletesen semlegesítődik vagy kicsapódik monoklonális anti-IL-2 antitesttel immunoadszorbensek, mint pl. Igsorb (Enzyme Center) jelenlétében vagy távollétében. Immunelektroforézisben az IL-2 polípeptid csupán egyetlen csapadékot mutat a megfelelő anti-IL-2 antitest ellen. Az IL-2 aktivitás stabil marad 2-merkapto-etanollal történő redukció után, és ez az aktivitás ellenáll a DNÄ-zzal és RNÁ-zzal történő kezelésnek, valamint az 56°C hőmérsékleten 30 percig tartó hőkezelésnek. Az aktivitás stabil 2 és 9 pH értékek között. A termelt IL-2 elősegíti a monoklonális funkcionális T sejtek (citotoxikus T-limfocita) növekedését, növeli a timocita mitogenezist, emeli az antitumorspecifikus citotoxikus T limfociták létrehozását az emlékezeti helyzetből az antigén távollétében, és lehet használni a természetes gyilkos sejt aktivitás fokozására YAC-1 és RLÜ 1 sejtek ellen. A találmányt általánosságban már leírtuk, ugyanez sokkal érthetőbbé válik, ha bizonyos jellegzetes példákra utalunk, amelyek azonban csak a szemléltetés célját szolgálják és nem jelentenek korlátozást, hacsak másképpen nem jelezzük. 1. Példa (1) Humán T leukémia sejtvonalat, Jurkat sejteket (amelyek Japánban, Nyugat-Német-19 országban és az Egyesült Államokban rendelkezésre állnak) szuszpendáljuk 10 téri/ /térf.% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápközegben és Röntgen-sugárral besugározzuk 10 000 röntgenig szobahőmérsékleten 50 másodpercen át, Exs 150/300—4 (Toshiba, Japán) röntgen-besugárzó készüléket használva, és ezután a besugárzott sejteket 5 napon át 37°C hőmérsékleten 5% C02 inkubátorban ■‘enyésztjük 1X105 sejt/ml kezdeti sejtsürűségge! a fentebb említett tápközegben. A mutált sejteket (0,2 sejt/üreg) 10 db, 96 üreggel ellátott laposfenekű mikrolemez üregeibe helyezzük, és 37°C hőmérsékleten 5% C02 inkubátorban tenyésztjük 21 napon át. A növekedést mutató üregekből nyert kiónokat ismételten átvisszük friss tápközegbe a klón-méret burjánzása érdekében és a burjánzott kiónokat 24 órán át tenyésztjük 1X106 sejt/ml kezdeti sejtsűrüségnél 50 pg/ml Con A jelenlétében és az IL-2 aktivitást a korábban leírt módszer szerint megmérjük. Ennek következményeként egy humán T sejt vonalat, amely Jurkat-111-nek jelölünk (a továbbiakban „J 111“) (ATCC 2RL 8129), és amelyet a szülő Jurkat-sejtből klónoztunk, szelektálunk, amelynek IL-2 termelőképessége a negyvenszeresére emelkedett a szülő törzs termelőképességéhez viszonyítva. A J-lll klónozott sejtvonal növekedhet a szokásos körülmények között és a növekedési sebesség csaknem azonos azzal, amelyet a közönséges Jurkat sejt mutat. (2) lXl05/ml J-lll sejtet inokulálunk 1000 ml szérummentes szintetikus tápközegber (RITC 55-9) (Sato, T. és munkatársai: Exp. Cell. Res. 138, 127—134 (1982) hengeres tenyésztő palackokban (Falcon 3027) és 4 napon át tenyésztjük 37°C hőmérsékleten, és a szaporított sejteket centrifugálással kinyerjük. A kinyert sejteket ismét inokuláljuk 4X106 sejt/ml koncentrációban a fentebb említett tápközegben, amelyhez 25 pg/ml koncentrációban ConA-t adtunk. Hengeres tenyésztő palackok (Falcon) négy darabja képez egy tételt, 1000 ml inokulált tenyészetet hellyezünk minden egyes tételbe. (3) 1,2X10® 25 pg/ml ConA-val 6 órán át stimulált Jurkat sejtet szuszpendálunk 8000 ml fiziológiás sóoldattal kiegyensúlyozott foszfát pufferban (a továbbiakban PBS). A sejteket kétszer mossuk centrifugálással és újra szuszpendáljuk 800 ml RSB oldattal (10 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,5; 10 mmól/liter NaCI; 1,5 mmól/liter MgC!2), amely ribonukleozid-vanadil komplexet (10 mmól/liter), amely nukleáz-inhibitor, tartalmaz. Ezután N1P-40 detergenst adunk hozzá, hogy a végső koncentrációja 0,05% legyen, majd gyengén keverjük és a sejtmagokat 5 perces centrifugálással eltávolítjuk 3000 rpm-nél 4°C hőmérsékleten. SDS-t (0,5%) és EDTA-t (5 mmól/liter) adunk a íelülúszóhoz és a citoplazma RNS-t azonos térfogatú fenol hozzáadásával extraháljuk. Háromszori fenolos 20 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
