197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 16-fragmens), vagy T4 bakteriofág polimeráz I-el, hogy eltávolítsuk a 3’ kinyúló végeket (5(a) ábra). A pIL-2-50A plazmidot kétszer emésztjük, Pstl-el és HgiAI-val, és egy nagyobb cDNS fragmenst izolálunk. A DNS-t ez után.vagy E. coli DNS polimeráz I-el kezeljük (Klenow-fragmens), vagy T4 bakteriofág DNS polimerázzal úgy, hogy a 3' kinyúló végek egy síkban legyenek. A fenti kezelt cDNS kódolja az IL-2 polipeptid 132 aminosavát, amint ezt az 5(a) ábra mutatja. Ezt a cDNS-t ezután hozzákapcsoljuk a fentiek szerint előkezelt pTrs-3 plazmidhoz, úgy, hogy az ATG indító kodon illeszkedjék az IL-2 cDNS CCT(Pro) szekvenciához. így egy pTIL -2-22 plazmidot nyerünk. A pTIL-2-22 trp promotor szekvenciája és IL-2 cDNS szekvenciája közötti csatlakozást is bemutatja az 5(a) ábra. A pTIL-22 plazmidnak kell irányítania az E. coli-ban a 132 aminosavat tartalmazó, prolinnal induló IL-2 polipeptid szintézisét. (ii) Mivel az is lehetséges, hogy az érett IL-2 alanint (21. helyzet) tartalmaz N-terminális aminosavként prolin helyett, a következő plazmidról is értekezünk, amely irányítja a 133 aminosavat tartalmazó IL-2 polipeptid szintézisét. A pTrs-3 plazmid tartalmaz egy egyedi Cla I helyet az SD szekvencia és az ATG szekvencia között (4. ábra). A plazmidot Cla I- el és Sál I-el emésztjük. A pIL 2.-50A-p!azmidot .részlegesen emésztjük Pst I-el, kezeljük E. coli DNS polimeráz I-el és a legnagyobb lineáris DNS-t izoláljuk. A DNS-t azután összekapcsoljuk egy szintetikus DNS kapcsolóval, amely egy restrikciós Xho I hasítási helyet tartalmaz, és egy pIL2-50A (Xho) plazmidot — amelybe a kapcsoló DNS be van vezetve az IL-2 kódoló szekvencia 3’ végétől lefelé — tartalmazó kiónt izolálunk. A pIL2-50A (Xho) plazmidot először Hgi Al-el emésztjük, és vagy E. coli Klenow-fragmenssel, vagy T4 DNS polimerázzal kezeljük. Xho 1- el emésztjük és a cDNS fragmenst izoláljuk. Ezt a cDNS fragmenst azután összekapcsoljuk pTrs-3 DNS-el, amelyet Clal-el és Sall-el és egy szintetikus DNS-sel előkezeltünk, amint ezt az 5(b) ábra bemutatja. így egy pTIL2-,21 plazmidot, amely irányíthatja egy 133 aminosavból álló, alaninnal kezdődő IL-2 polipeptid szintézisét E. coli ban, nyerhetünk, amint ezt az 5(b) ábra bemutatja. Hasonló konstrukciókat lehet kés-zíteni Xhol kapcsoló alkalmazása nélkül is. (iii) Különböző méretű, különböző N-terminális aminosavval rendelkező IL-2 polipeptideket lehet előállítani a pTrs-3 kifejeződni képes plazmid hordozóval a következő eljárás szerint. A klónozó IL-2 cDNS a pIL2-50A- ban tartalmaz egy egyedülálló Dde I helyet a 81.—85. nukleotid helyeknél. A pIL2-50A (Xho) plazmidot Dde I-el emésztjük, és a cDNS nagyobb részét tartalmazó DNS fragpnenst izoláljuk. A fragmens szintén tartal15 maz mintegy 3000 bázispárt a pBR 322-ből (5(c) ábra). A DNS fragmens Bal 31 exonukleázzal kezeljük, majd Xho I-el emésztjük. A fentebbi kezelt DNS-t azután összekapcsoljuk pTrs-3-mal, amelyet Sph I-el emésztettünk, vagy Klenow-fragmenssel, vagy T4- -DNS polimerázzal kezeltünk, majd _Saj I-el emésztettünk, ahogyan ezt az 5(c) ábrában bemutatjuk. Az összekapcsolt DNS-t azután átvisszük E. coli HBlOl-be. és a humán IL-2-t kifejező bakteriális kiónokat kiszűrjük. Ezek a kiónok különböző méretű humán IL-2-t fejeznek ki, mivel a humán IL-2 N-terminálisnak megfelelő DNS különbözőképpen van elszakítva. így IL-2 cDNS-t hordozó pTIL2- -14-et és pTIL2-15-öt nyerhetünk. (iv) Az IL-2 cDNS-t ki lehet fejezni pKT 218 alkalmazásával (K. Tolmage ajándéka) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 3369—3373 (1980)). A pKT218 plazmidot Pst I-el emésztjük és egy, a pIL-2-50A DNS-nek HgiAI-val és Pst I-el történő emésztésével nyert IL-2 cDNS-inzerttel kapcsoljuk össze. (6. ábra). A kapcsolás eredményeképpen létrejött pKIL2- -21 plazmid irányítja az egyesített polipeptid szintézisét E. coli-ban, amely egyesített polipeptid az IL-2 133 aminosavát tartalmazza és a ß-Iaktamäz aminosavait (az első metíonin le van hasítva az E. coli-ban). (v) Egy pTuBIP-5 kifejeződni képes plazmidot, amelyben a promotor szekvencia a tuf B-hez van beiktatva pBR322-be, már korábban megalkottak (Taniguchi és munkatársai: SEIKAGAKU, 53, 966 (1981)) . A plazmid egy egyedi Cla I helvet tartalmaz és ez 2 bp-re helyezkedik el az SD szekvenciától lefelé, amint ezt a 7. ábra mutatja. Mivel a pTrs-3 szintén tartalmaz egy Cla 1 helyet az SD szekvencia és az ATG induló szekvencia között, és mivel ez a Cla I hely nem pusztul el egy kifejeződni képes plazmid megalkotása során pTrs-3 és IL-2 cDNS-t alkalmazva, amint ezt fentebb leírtuk, nagyon egyszerű helyettesíteni a bakteriális Trp promotort a tuf B prornotorral úgy, hogy a humán IL-2 cDNS a tuf B promotor ellenőrzése alatt fejeződjék ki. így pl. pTIL2-22-t emésztünk Cla I-el és Pvu Il-vel és az IL-2 cDNS-t tartalmazó DNS fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst azután összekapcsoljuk pTUBlP-5 DNS-sel, elő-emésztiük Cla I-el és Pvu II-vel és egy pTuI12-22 plazmidot alakítunk ki, amint ezt a 7. ábrában ábrázoljuk. Az IL-2 aktivitást a pTuIL2-22 plazmidot magába foglaló E. coli HB 101 extráktumában lehet kimutatni. (vi) Hasonló konstrukciót lehet megalkotni pl. pTIL2-21-et és lényegében minden olyan kifejeződni képes plazmidot alkalmazva, amelyet pTRS-3 alkalmazásával alakítottak ki. Lehet optimalizálni a távolságot az SD és ATG szekvenciák között pl. a pTuIL2-22 emésztésével Cla l el, néhány DNS bázispárt eltávolítva (vagy hozzáadva) Bal 31 vagy SÍ vagy DNS polimeráz I (E. coli) segítségével, majd a plazmidot újra összekapcsolva. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
