197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 szekvenciával rendelkeznek; a 108—110 helyzeteknél GCA szekvenciával kezdődő DNS-ek, amelyek a GCA szekvenciát követő, legalább az ATC kodonig tartó bázisszekvenciával rendelkeznek; és a 111 —113 helyzeteknél CCT szekvenciával kezdődő DNS-ek, amelyek a CCT szekvenciát követő, legalább az ACT szekvenciáig tartó bázisszekvenciával rendelkeznek. A jelen találmány szerinti gének lehetnek még olyan DNS-ek, amelyek az ACT szekvenciával végződnek az 504.—506. helyzeteknél és A-val kezdődnek az 1. helyzetnél, ATG a szekvenciájuk a 48.—50. helyzetnél, GCA a szekvenciájuk a 108.—110. helyzetnél vagy CCT a szekvenciájuk a 111 —113. helyzetnél. A jelen találmány szerinti gének továbbá lehetnek olyan DNS-ek, amelyek TGA szekvenciával végződnek a 507.—509. helyzetnél és A-val kezdődnek az 1. helyzetnél, ATG a szekvenciájuk a 48.—50. helyzetnél, GCA a szekvenciájuk a 108.—110. helyzetnél vagy CCT a szekvenciájuk a 111.—113. helyzetnél. A jelen találmány szerinti gének továbbá olyan DNS-ek, amelyek C-vel végződnek a 801. helyzetnél és A-val kezdődnek az 1. helyzetnél, ATG a szekvenciájuk a 48.—50. helyzetnél, GCA a szekvenciájuk a 108.— 110. helyzetnél vagy CCT a szekvenciájuk a 111.— 113. helyzetnél. A jelen találmány szerinti gének ezen felül lehetnek olyan DNS-ek, amelyek poli(A)-val végződnek és ATG kodonnal indulnak a 48.—50. helyzetben, GCA a szekvenciájuk a 108. —110. helyzetben vagy CCT a szekvenciájuk a 111.—113. helyzetben. A jelen találmány szerinti gének lehetnek olyanok, amelyek bázis szekvenciája megfelel az 1, II és III. Aminosav-szekvenciáknak. Ezen túl olyan polipeptidek is rendelkezhetnek IL-2 aktivitással, amelyekben az I. Aminosav-szekvencia egy vagy több aminosava hiányzik, vagy olyan polipeptidek, amelyekben az 1. Aminosav-szekvencia egy vagy több aminosava helyettesítve van egy vagy több aminosavval. Ennél fogva azok a gének, amelyek ilyen polipeptideket kódolnak, szintén a jelen találmánynak megfelelő gének. Hasonlóképpen azok a gének, amelyek többlet kapcsolattal rendelkeznek egy vagy több olyan bázis-szekvenciához, amely képes kifejezni egy vagy több többlet-aminosavat az I, II vagy III. Aminosav-szekvenciához, szintén megfelelnek ennek a találmánynak mindaddig, amíg a többlet hozzátett aminosavak nem zavarják a polipeptidek tevékenységét az IL-2 aktivitás kifejtésében. A módosított kapcsolt többlet-aminosav terület, amely zavarja a polipeptid-funkciót az IL-2 szempontjából, is használható ebben a találmányban olyan mértékig, amíg a kapcsolt többlet-terület könnyen eltávolítható. Ez a helyzet azonos a DNS kapcsolt többlet-területénél, annak a génnek a 3’ terminálisánál, amely az I, II, ill. III. Aminosav-szekvenciának felel meg; ez a DNS többlet-terület kódolja az I, II, ill. Ill Amino- 8 13 sav-szekvencia C terminálisánál levő többlet aminosavakat. Ezért az ilyen polipeptideket kódoló gének alkalmazása szintén beletartozik a jelen találmányba. A rekombináns DNS-eket, amelyek irányítják az IL-2 termelését az élő sejtekben, különböző módszerekkel lehet konstruálni. így pl. az IL-2 cDNS kódoló szekvenciát be lehet iktatni egy kifejeződni képes hordozóba a promotor-szekvenciától lefelé. Egy másik változat szerint egy promotor szekvenciát hordozó cDNS darabot be lehet iktatni az IL-2 kódoló szekvenciába fölfelé, mielőtt vagy miután a cDNS-t beiktatják a kifejeződni képes hordozóba. A prokarióta vagy eukarióta sejtek — amelyek kifejezik az IL-2 cDNS-t és IL-2 polipeptidet termelnek — előállítási eljárását az alábbiakban sokkal pontosabban magyarázzuk meg: (1) Az IL-2 cDNS kifejeződése E. coli-ban Abból a célból, hogy az IL-2 cDNS-t kifejezzük E. coli-ban. a cDNS-t egyesítjük különböző bakteriális promotorokkal, és a promotoroktól lefelé levő cDNS-t tartalmazó hibrid plazmidokat nyerünk. A plazmidokat bevisszük pl. E. coli HB101 törzsbe és humán IL-2 aktivitással rendelkező fehérje-terméket szintetizáló baktériumokat klónozunk. Lényegében bármilyen bakteriális promotor irányíthatja az IL-2 cDNS kifejeződését, amikor azok megfelelően illeszkednek a cDNS-hez. Ilyen cDNS kifejeződésére itt írunk le példákat. Az IL-2-höz klónozott cDNS egy 153 aminosavból álló polipeptidet kódol, amint ezt a 2. ábra mutatja. Az N-terminális terület, amely ennek a polipeptidnek mintegy 20 aminosavjának felel meg, meglehetősen hidrofób, és ez jellemző a legtöbb szekréciós fehérjére. Egy ilyen hidrofób szekvencia, az úgynevezett „szignál“ szekvencia, lehasad a szekréciós folyamat során. Ezért az érett IL-2 polipeptidnek kevesebb, mint 153 aminosavat kell tartalmaznia. Ezért kívánatos kifejezni azt a cDNS-részt, amely kódolja az érett IL-2 polipeptidet, de nem kívánatos kifejezni azt a részt, amely az IL-2 „szignál“ szekvenciának felel meg. (i) Egy kifejeződni képes plazmid hordozónak, a pTrs-3-nak, amely magába foglalja az E. coli trp promotort, ennek riboszóma kötőhelyét (SD szekvencia) a vezető pepiidhez, a konstrukcióját már korábban leírták (G. Miozzari és Yanofsky, C.: J. Bacterial. 133, 1457— 1466 (1978)), és leírták egy ATG kodont, amely 13 bp-re (bázispár) helyezkedik el az SD szekvenciától lefelé (Nishi és munkatársai: SEIKAGAKU, 54, 8, 676 (1982)). A plazmid hordozó szintén tartalmaz egy egyedi Sphl helyet éppen az ATG induló szekvenciától lefelé (4. ábra). Az IL-2 cDNS kifejeződése érdekében a plazmidot először SphI-el emésztjük, és vagy E. coli DNS polimeráz I-el kezeljük (Klenow-14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
