197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 12 ridizálunk hődenaturált plazmid DNS-sel, majd a DNS-mRNS hibridet rögzítjük a nitrocellulóz szűrőpapírra. Ezeket a szűrőpapírokat azután kis sókoncentrációjú pufferekkel, mint pl. 1 mmól/literes HEPES puffer, vagy 10 mmól/literes NaCI, mossuk, és a szűrőpapíron adszorbeált mRNS-t extraháljuk mintegy 1 percig 95°C hőmérsékleten a következő oldattal: 0,5 mmól/1 EDTA, 0,1% SDS. A tisztított mRNS-t oligo dT-cellulóz oszlopkromatográfiás elúcióval történő elúcíóval nyerjük ki. Ezután az mRNS-t fehérjébe fordítjuk le. Xenopus laevis petébe történő mikroinjektálással az IL-2 aktivitás meghatározása érdekében, vagy az mRNS-t egy fehérjébe fordítjuk le mRNS-függő retikulocita vagy búzacsíra jn_yitro_sejtmentes transzlációs (lefordító) rendszert alkalmazva, az IL-2 aktivitás analízise érdekében anti-IL-2 antitestet alkalmazva. Ezek szerint az eljárások szerint az a csoport, amelyben az IL-2 aktivitás kimutatható, ismételten tovább osztható kisebb számú transzformáns kiónokat tartalmazó csoportokba, amíg egy egyedi, IL-2 DNS-sel rendelkező klón marad. Hogy az IL-2 termelő transzformánsokból IL-2 polipeptidet kódoló cDNS-t nyerjünk, a transzformánsban levő rekombináns DNS-t elkülönítjük és restrikciós endonukleázzal elhasítjuk. A hasítással képződött DNS fragmensekből a beiktatott cDNS frakciókat elkülönítjük. pIL2-50A rekombináns DNS-ből nyert, IL-2 polipeptidet kódoló Pst I DNS-beiktatott rész (inzert) teljes nukleotid szekvenciáját Maxam és Gilbert (Meth. Enzym. 65, 499—560 (1980)) módszerével és a didezoxinukleotid lánc végződési módszerrel (Smith, A. J. M.: Meth. Enzym. 65, 560—580 (1980)) határozzuk meg. A cDNS inzert restrikciós endonukleáz hasítási térképét és az inzert bázis-szekvenciáját az 1. ábra és a 2(a) ábra mutatja, amelyekben a cDNS BstNI, Xbal és BstNI (ebben a sorrendben) restrikciós endonukleázokkal hasított helyekkel bír. Az inzert DNS szekvenciája egy egyedi nagy nyitott leolvasó keretet tartalmaz. Az első ATG szekvencia, amely általában induló szekvenciaként szolgál eukariótákban (Kozak, M.: Cell, 15, 1109—1123 (1978)), a 48—50 nukleotidnál található az 5’ végtől. Ezt az ATG-t követi 152 kodon, mielőtt a TGA befejező triplettel találkozunk az 507—509 nukleotidoknál. Az mRNS 3’-poli (A)-végződésének megfelelő A-gyökök egy szakaszát találjuk a cDNS végénél és ezt előzi meg az AATAAA hexanukleotid (771—766 hely), amelyet általában meg lehet találni a legtöbb eukarióta mRNS- ben (Proudfoot, N. J. és Brownlee, C. G.: Nature, 263, 211—214 (1976)). Az aminosav-szekvenciát, amelyet a cDNS kódol, le lehet vezetni a 2(b) ábra alapján (I Aminosav-szekvencia), és az I aminosav 11 szekvencia polipeptidje 153 aminosavat tartalmaz és molekulatömege 17631,7 daltonnak van kalkulálva. Amint ezt leírták az eddig ismert szekréciós fehérjék legtöbbjében közös vonásként (Blobel, G. és munkatársai: Sym. Soc. exp. Med., 33, 9—36 (1979)), a levezetett IL-2 polipeptid N-terminális területe szintén meglehetősen hidrofób és ez a terület valószínűleg szignál peptidként szolgál, amely az érett IL-2 kiválasztási folyamata során lehasad. Ilyen lehasadás történik vagy Ser és Alá között a 20. és 21. helyzeteknél, illetve Alá és Pro között a 21. és 22. helyzeteknél, olyan polipeptidet képezve, amely II és III aminosav szekvenciával bír, mivel hasonló hasítási helyeket gyakran találtak más szekréciós fehérjéknél (Blobel, G. és munkatársai: Symp. Soc. exp. Med. 33, 9—36 (1979)). Az érett IL-2 polipeptid azután 132 vagy 133 aminosavat tartalmaz 15420,5 dalton vagy 15349,4 dalton kalkulált molekulatömeggel. Ezt az értéket azután összehasonlítjuk a Jurkat sejtekből nyert humán IL-2 fehérjéről leírt értékekkel (15000 dalton) (Gillis, S. és munkatársai: Immunological Rev., 63, 67— 209, (1982)). Ezen kívül, a bázis szekvenciában 111 —113 helyzetnél levő CCT kodontól induló DNS fragmensről, amely ennél fogva a Prc-nál, 22. helyzetnél induló polipeptidet kódolja (III Aminosav-szekvencia, 2(b) ábra), bebizonyosodott, hogy olyan polipeptidet fejez ki, amely IL-2 aktivitással rendelkezik, amint ez az 5. példában be lesz mutatva. Szintén bizonyítást nyert, hogy a bázis szekvenciában 107.—110. helyzeteknél levő GCA szekvenciával induló DNS fragmens, amely ennél fogva a 21 helyzetnél levő Ala-nál induló polipeptidet kódolja (II. Aminosav-szekvencia a 2(b) ábrában), olyan polipeptidet fejez ki, amely IL-2 aktivitással rendelkezik, amint ezt a 8. példában majd bemutatjuk. Ismeretes, hogy eukarióták génjei gyakran mutatnak polimorfizmust pl. humán interferon géneknél. (Taniguchi és munkatársai: Gene. 10, 11 —15 (1980); Ohno és Taniguchi: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5305—5309 (1980); Gray és munkatársai: Nature, 295, 501—508 (1981)). Bizonyos esetekben a polimorfizmus társul a fehérjetermék bizonyos aminosavainak helyettesítésével, más esetekben viszont a fehérje szerkezete változatlan marad. Humán IL-2 cDNS esetében egy másik cDNS kiónt (pIL2—503), amelyben az „A“ maradékot a pIL-5C'A cDNS 503. helyzeténél (2, ábra) egy „G“ maradék helyettesíti, lehet észlelni. Más cDNS kiónok bizonyos bázis-helyettesítésekkel a pIL2—50A cDNS-hez viszonyítva szintén várhatók. Amint az a fentiekből megérthető, a jelen találmány szerinti gének lehetnek: a 2(a) ábrában bemutatott bázis-szekvenciával rendelkező DNS; a 48—50 helyzeteknél ATG szekvenciával kezdődő DNS-ek, amelyek az ATG szekvenciát követő, legalább az 504—506 helyzetnél levő ATG szekvenciáig tartó bázis-7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
