197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 tást pBR 322-ben. A plazmid tartalmaz egy egyedi dal helvet is és ez 2 bp-vel lefelé helyezkedik el az SD szekvenciától, amint ezt a 7. ábra mutatja. Mivel a pTrS-3 tartalmaz egy Clal helyet is az SD szekvencia és az ATG indító kodon között, és mivel ezt a Clal hely a kifejeződésre képes plazmid előállítása során pTrS-3-at és IL-2 cDNS-t használva nem roncsolódik el, amint ez az 5. példában is le van írva, nagyon egyszerű helyettesíteni a bakteriális trp promotort a tufB promotorral úgy, hogy az IL-2 cDNS a tufB promotor ellenőrzése alatt fejeződjék ki. Ezért a pTIL2-22 plazmidot (30 pg) Clal és Pvull restrikciós enzimekkel hagyományos módon elhasítjuk. Az IL-2 cDNS-t tartalmazó fragmenst (kb 2,2 kb) izoláljuk és agaróz gél elektroforézissel tisztítjuk, így nyerünk ki 3 pg DNS-t. Másrészt 20 pg pTuBIP-5 vektort hasítunk hasonlóképpen Clal-el és PvuII-vel. és az ampicillin rezisztencia gént tartalmazó nagyobbik fragmenst (kb 3,4 kb) izoláljuk és agaróz gél elektroforézissel tisztítjuk, így nyerünk ki 3,5 pg DNS-t. Ez után az így kinyert két fragmenst, vagyis a tufB promotort tartalmazó fragmenst (kb 3,4 kb) és az IL-2 cDNS-t tartalmazó fragmenst (kb. 2.2 kb) a következő módon kapcsoljuk össze: 1.2 pg IL-2 cDNS-t tartalmazó fragmenst és 0,3 pg tufB promotort tartalmazó fragmenst összekeverünk 0,8 egység T4 DNS ligázzal 66 mmól/literes Tris-HCl-ben (pH 7,5), amely 6,6 mmól/liter MgCl2-t, 1 mmól/liter ATP-t és 10 mmól/liter DTT-t tartalmaz, és a keveréket reagálni hagyjuk egy éjszakán át. Az így összekapcsolt plazmidot használjuk azután az E. coli HB 101-be történő transzformálásra a hagyományos eljárás szerint. Az ampiciItint tartalmazó L-tápközeges agar lemezen megjelenő transzformánsok közül 8 olyan telepet izolálunk, amely tartalmaz IL-2 cDNS részt, mint pl. a pTuIL2-22 a 7. ábrában, ezekből az 5. példában leírt módon plazmid DNS-t preparálunk ki. A pTuIL2-22-t tartalmazó E. coli HB 101 törzset L-tápközegben (100 ml) tenyésztjük 37°C hőmérsékleten. Amikor az O. D. 650 mp-nái mintegy 0,5—1,0 lesz, a bakteriális sejteket összegyűjtjük, 20 mmól/literes, 30 mmól/liter NaCl-t tartalmazó Tris-HCl pufferral mossuk és ugyanennek a puffernak 2 ml-ében felszuszpendáljuk. Az előállított fehérjét hasonlóképpen vonjuk ki, mint ahogyan ez az 5. példában történt. A kivont IL-2 aktivitás 6,000 és 56,000 egység/ml között van. ApTuML2-22-t tartalmazó Escherichia coli HB 101 törzset (AJ 12010) FERM-BP 246 befogadási számmal letétbe helyeztük. 7. Példa IL-2 cDNS-t hordozó pGIL2-22 plazmidot alakítunk ki pGL 101-ből (Roberts, T. M. és Laucer, G. D.: Meth. Enzym. 68, 473—483 (1979)) és pTIL2-22-ből, az 5. ábrában bemutatott eljárás szerint. Egy lac promotort tartalmazó pGL 101 plazmidot (20 pg) hasítunk el Pvull restrik33 18 ciós enzimmel hagyományos módon, és előbb fenolos kezelés, majd kloroformos kezelés, végül etanolos kicsapás után 17 pg DNS-t nyerünk ki. Másrészt pTIL2-22-t (75 pg) hasítunk el Clal-el és Sall-el, és agaróz gél elektroforézissel 2,2 pg IL-2 cDNS-t tartalmazó DNS fragmenst nyerünk ki. A fragmenst DNS polimeráz I-el (Kjenow-fragmens) történő kezeléssel egyenesre alakítjuk, majd az így nyert két fragmenst (0,25 pg és 0,66 pg) összekapcsoljuk 1 egység T4 DNS ligázzal hasonló módon, ahogyan ezt a 6. példában tettük. Az így összekapcsolt plazmidot használjuk azután az E. coli HB 101 transzformálására hagyományos módszer szerint. A transzformánsok közül az IL-2 cDNS-t tartalmazó Clal—Sáli fragmens beiktatással rendelkező transzformánsok a vizsgálandó minták. Ezeket a transzformánsokat tenyésztjük azután 10 ml, 25 pg/ml ampicillint tartalmazó X tápközegben és a plazmid DNS-t az 5. példában leírt módon nyerjük ki, így egy, a lac promotortól éppen lefelé levő IL-2 cDNS ATG indító szekvenciával rendelkező plazmid DNS-t nyerünk Pstl-el és Xba-val történő hasítással. Az így készített pGIL2-22-t 100 ml, 25 pg/ml ampicillint és 25 pg/ml streptomicint tartalmazó L-tápközegben inokuláljuk és tenyésztjük. Amikpr az optikai sűrűség 65 mp-nái mintegy 0,5 lesz, izopropil-ß-D-tiogalaktopiranozidot (IPTG) adunk hozzá 1 mmól/liter koncentrációban, egy órával később a bakteriális sejteket összegyűjtjük és a sejt-extraktumot a 6. példában leírt módon állítjuk elő. A kiextrahált IL-2 aktivitás 6,000 és 80,000 egység között van. A pGIL2-22-t tartalmazó Escherichia coli HB 101 törzset (AJ 12011) letétbe helyeztük FERM-BP 247 bevételi számon. 8. Példa pTrS-3 plazmidot (10 pg) először elhasítunk Sáli restrikciós enzimmel és a Sáli helyet egyenesre alakítjuk DNS polimerázzal (Klenow-fragmens) vagy T4 DNS polimerázzal történő kezeléssel. Clal-el történő hasítás után a trp promotor területet tartalmazó nagyobb fragmenst agaróz gél elektroforézissel izoláljuk hagyományos módon, 3 pg DNS-t nyerve ki. Másrészt 11 pg, a pIL2-50A Pstl-es hasításával nyert cDNS inzertet HgiAI-el elhasítjuk. T4 DNS polimerázzal kezeljük és a nagyobb fragmenst agaróz gél elektroforézissel izoláljuk és tisztítjuk. így az IL-2 132 aminosavát kódoló cDNS fragmenst nyerjük ki 7,2 pg mennyiségben. Ez után 0,45 pg trp promotort tartalmazó fragmenst (lásd fentebb), 0,5 pg IL-2 cDNS-t tartalmazó HgiAI-Pstí iragmenst és szintetikus oligonukleotidokai (20—20 p mól), úgymint (5’) CG AT AAGCT ATGGCA (3’) és (3*) TATTCGATACCGT (5’) mindkettő foszforilezve az 5’-terminálisnál, ahogyan ezt az 5. példában leírtuk (lásd 5(b) ábra). 34 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65
