197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 36 Az így összekapcsolt plazmidot használjuk az E. coli HB 101 transzformálására. A megjelenő transzformánsok közül a célnak megfelelő transzformánsokat a következő módon szelektáljuk. A mind az IL-2 cDNS-t, mind a szintetikus oligonukleotidokat hibridizálni képes transzformáns-jelölteket először telep-hibridizációs módszerrel szelektáljuk, majd a 2(a) ábrában 111 —113 helyeknél levő CCT szekvenciával induló (CCTACT.....) DNS fragmens beiktatásával rendelkező, ATGGCA szekvenciától éppen lefelé levő transzformánsokat Pstl. Xbal hasítással szelektáljuk. A fenti transzformánsokat, amelyek pTIL2- -21 a-t vagy pTIL-2-21b-t tartalmaznak, L-tápközegben tenyésztjük hasonló módon, ahogyan ezt az 5. példában bemutattuk, és nagy IL-2 aktivitás található a transzformánsok sejt-extraktumában, amikor azt az 5. példában leírt módon mérjük. A pTIL2-2/a-val rendelkező Escherichia coli HB 101 törzset (AJ 12013) és a pTIL2- -2/b-vel rendelkező Escherichia coli HB 101 törzset (AJ 12014) letétbe helyezzük FERM-BP 1248, illetve FERM BP 249 bevételi számon. A fenti példákban alkalmazott E. coli K 1776 és HB 101 törzsek (Boyer, H. W. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 41, 459 (1969)) ismertek és bárki számára hozzáférhetők. Ezen kívül a gazdaszervezeteket ki lehet nyerni a letétbe helyezett transzformánsokból is olyan módon, hogy a transzformánsokat L-tápközegben tenyésztjük 37°C hőmérsékleten, hogy elbocsássa az idevonatkozó rekombináns DNS- eket a transzformánsban, és kiválasztjuk azokat a törzseket, amelyek érzékennyé váltak tetraciklinre és ampicillinre éppen úgy, mint a gazdaszervezet. A pBR322 plazmid (amely kereskedelmi forgalomban is kapható pl. a Bethesda Research Laboratory-nál), valamint a pCE-1, PtrS-3 és pGL 101 plazmidok mind ismertek és bárki számára rendelkezésre állnak. Ezen kívül a plazmid vektorokat ki lehet nyerni a letétbe helyezett transzformánsokból is olyan módon, hogy a rekombináns plazmid DNS-t a transzformánsból hagyományos módon elkülönítjük, vagy a plazmid vektorokat olyan módon különítjük el, amely természetesen nyilvánvaló a megfelelő példákban levő kitanítások alapján, fgy pl. pCE-l-et ki lehet nyerni a pCEIL-2 Pstl-el történő emésztésével és a képződött nagyobb DNS fragmens elkülönítésével. Ezen kívül a pTrS-3 és pTuBlP-5 letétbe van helyezve mint E. coli FERM-P 6735, illetve E. coli ATCC 31878. A találmány jelen leírása után azok, akik ezen a téren járatosak, megérthetik, hogy ugyanezt el lehet végezni a különböző feltételek, paraméterek széles és egyenértékű skálájában anélkül azonban, hogy ez a találmány szellemét és hatáskörét, vagy ezek bármilyen megvalósulását befolyásolná. 35 1. Eljárás interleukin-2 (IL-2) mRNS előállítására, azzal jellemezve, hogy humán T-limfocita, transzformált humán T-limfocita vagy humán T-sejt hibridoma sejtekből vagy ezek tenyészetéből RNS-t állítunk elő, ebből oligo(dT) cellulózon és szacharóz sűrűség gradiens centrifugálással az mRNS-t dúsítjuk (Elsőbbsége: 1982.12.15.) 2. Eljárás interleukin-2 (IL-2) aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló gén előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított mRNS segítségével egyszálú, majd kétszálú cDNS-t készítünk, ezt megfelelő vektorba iktatva E. coliba transzformáljuk, a transzformánsokból plazmidokat állítunk elő, az IL-2 génnel rendelkező plazmidokat IL-2 mRNS-sel hibridizálva kiválasztjuk, és a plazmidokból az IL-2 akt vitással rendelkező peptideket kódoló gént megfelelő restrikciós enzimes emésztéssel kihasítjuk. (Elsőbbsége: 1982.12.24.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás a 2 (a) ábrán bemutatott bázisszekvenciával, de annak legalább a 111 —113. helyétől legalább az 504—506. helyéig terjedő részével rendelkező gén előállítására, azzal jellemezve, hogy a hibridizálás után kiválasztott plazmidokkal a megfelelő restrikciós enzimes emésztéssel a tárgyi kör szerinti gént hasítjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.24.) 4. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás a 2(a) ábra számozása szerinti 48—50. helynél levő ATG szekvenciával kezdődő és az 504 —506. helynél levő ACT szekvenciával végződó gén előállítására, azzal jellemezve, hogy a restrikciós enzimes emésztéssel a tárgyi kör szerinti gént hasítjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.24. ) 5. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás a 2(a) ábra számozása szerinti 108—110. helynél levő GCA szekvenciával kezdődő és az 504—506. helynél levő ACT szekvenciával végződi) gén előállítására, azzal jellemezve, hogy a restrikciós enzimes emésztéssel a tárgyi kör szerinti gént hasítjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.24. ) 6. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás a 2(a) ábra számozása szerinti 111 —113. helynél levő CCT szekvenciával kezdődő és az 504—506. helynél levő ACT szekvenciával végződő gén előállítására, azzal jellemezve, hogy a restrikciós enzimes emésztéssel a tárgyi kör szerinti gént hasítjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.24. ) 7. A 2. vagy 3. igénypont szerinti.eljárás a 2(a) ábra számozása szerinti 1. helynél levő A bázissal kezdődő és az 504—506. helynél levő ACT szekvenciával végződő gén előállítására, azzcl jellemezve, hogy a restrikciós enzimes emésztéssel a tárgyi kör szerinti gént hasítjuk ki. (Elsőbbsége: 1982.12.24.) 8. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás a 2(a) ábra számozása szerinti 1. helynél levő 19 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
