197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 extrakció után az RNS-t kicsapjuk két térfogat etanollal és a csapadékot centrifugálással kigyűjtjük, amelyet oldhatóvá teszünk 10 mmól/ /liter Tris-HCl pufferban (pH 7,5). A nyert RNS mennyisége 196 mg. Az mRNS frakcionálását oligo(dT)-cellulózon történő affinitás-kromatográfiát alkalmazva hajtjuk végre (P. L. Biochemicals, 7. típus). Az adszorpciós oldat összetétele: 20 mmól/liter Tris-HCl, 0,5 mól/liter NaCl, 1 mmól/liter EDTA és 0,5% SDS, pH-ja 7,5, és az elűciót vízzel és 10 mmól/liter Tris-HClel. (pH 7,5) hajtjuk végre, az oszlop átmosása után pufferral. (20 mmól/liter Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mól/liter NaCl, 1 mmól/liter Tris-HCl). Az így nyert eluált mRNS 3,6 mg. Ez után 2,4 mg így nyert mRNS-t szacharóz sűrűség gradiens centrifugálással frakcionál-1 . h 21 juk (5—2,5% szacharóz sűrűség gradiens egy pH 7,5-ös oldatban, amelynek összetétele 50 mmól/liter Tris-HCl, 1 mmól/liter EDTA és 0,2 mól/liter NaCl, centrifugálás 26,000 5 ford/perc sebességgel 24 órán át 4°C hőmérsékleten) és az mRNS 11 — 12S frakcióját a 12., 13. és 14. frakciókba frakcionáljuk 59 pg. 46 pg, illetve 60 pg mennyiségben, (4) A 13. frakcióban nyert mRNS-t mikroinjektáljuk Xenopus laevis oocitáiba (50 ng mRNS/tojás) és a tenyészet felülúszója szolgál az IL-2 aktivitás mérésére. Amint az 1. Táblázat mutatja, a 3H TdR beépülésének 15 növekedése és az aktivált T-limfociták számának növekedése bebizonyítható, világosan igazolva, hogy az mRNS ebben a frakcióban tartalmaz humán .IL-2 mRNS-t. Táblázat / 22 Minta Hígítás 3H-TdR befő-l-T n . - X IL-2 mennyisege gás /cpm/ /egység/.ml/ Kontroll I __ 553 0 /közeg a méréshez/ Kontroll II X2 590 0 /nem kezelt tojástenyészet felülúszó-X3 572 ja/ 13. frakció X8 14,683 32 transzlációs termeke X32 10,165 /b/ Hígítás T-limfocita IL-2 mennyisege sej tszám /egység/ml/ /db/üreg/ Kontroll I X2 0 0 /Közeg a méréshez/ X16 0 Kontroll II X2 0 0 /A nem kezelt tojástenyészet felülüszója / X16 0 A 13. frakció X2 1 15 40 transzlációs termeke X16 55 x Az egységet úgy kalkuláljuk, hogy összehasonlítjuk a beépített 3H-TdR menynyiséget a standard IL-2 mennyiségevei /10 egység/ml/ probit-analizis szerint (5) Ez után cDNS-t szintetizálunk az IL-2 mRNS-t tartalmazó 11 — 12S mRNS 13. frakciójából in vitro és rekc:nbináns DNS-t képezünk pBR322 plazmid vektorral. Escherichia coli-t transzformálunk a rekombináns DNS-el, és az IL-2 cDNS-t szerzett kiónokat a következőképpen szelektáljuk: (5—1) 50 mmól Tris-HCl puffert (pH 7,5), 30 mmól NaCl-t, 6 mmól MgCl2-t, 5 mmól 65 ditiotreitolt (a továbbiakban DTT), 0,5 mmól 12
