197938. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interleukin-2-polipeptidet kódoló gén, ezt a gént hordozó rekombináns DNS, a rekombináns DNS-sel rendelkező élő sejtvonal előállítására és eljárás interleukin-2 előállítására ilyen sejtekkel
197938 dATP-t, dGTP-t, dCTP-t, dTTP-t (a dCTP 32P radioaktívan jelzett), 0,7 pg oligo (dT) 10- et, 10 (ig mRNS-t és 15 egység AMV reverz transzkriptázt (J. W. Beard) összekeverünk és 90 percen át 41°C hőmérsékleten tartunk. A reakció leállítása után a DNS-t kinyerjük fenolos kezelés után etanolos csapadékként, és a DNS-t feloldjuk egy 7,5 pH-jú oldatban, amely 20 mmól/liter Tris-t és 1 mmól/liter EDTA-t tartalmaz. 2,5 pg ss-cDNS-t szintetizálunk. Hogy eltávolítsuk az oldatban jelen levő mRNS-t, az oldatot 0,33 n NaOH koncentrációra állítjuk be NaOH hozzáadásával, 15 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az oldatot semlegesítjük azonos térfogatú 1 mól/literes Tris-HCl pufferral (pH 7,5) és Sephadex G-50 oszlopon átengedjük. A kinyert cDNS 1,8 pg. (5—2) 50 mmól foszfát puffert (pH 7,5), 10 mmól MgCl2-t, 10 mmól DTT-t, 0,75 mmól dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t (a dCTP 3H radioaktívan jelzett), 1,8 pg ss-cDNS-t és 8 egység polimeráz I-et (BRL, Egyesült Államok) összekeverünk és reagálni hagyjuk 15 órán át 15°C hőmérsékleten. A reakció leállítása után a DNS-t kinyerjük fenolos és kloroformos kezelés után efanolos csapadék formájában. 1,10 pg ds-cDNS-t alakítunk ki. 50 mml nátrium-acetátot (pH 4,5), 0,2 mól NaCl-t, 1 mmól ZnCl2-t és 1,10 pg ds-cDNS-t inkubálunk 20 percen át 37°C hőmérsékleten, 0,25 egység nukleáz Sret (Sankyo, Japán) adunk, hozzá, majd további 15 percen át inku báljuk. . A reakció leállítása után a reakcióterméket, amelyet kétszer kezelünk fenollal, Sephadex G-50-re visszük, így 0,55 pg ds-cDNS-t nyerünk. (5—3) 0,14 mól kálium kakodilát, 30 mmól Tris bázis, 0,1 mmól DTT, 1 mmól CaCI2, 0,64 mmól 32P-dCTP (fajlagos aktivitás 2JX X106 cpm/nmól), 0,55 pg ds-cDNS és 5 egység terminális transzferáz (BRL) keverékét inkubáljuk 7 percen át 37°C hőmérsékleten, majd fenolos kezelés után Sephadex G-50 oszlopra visszük, 0,5 pg DNS-t nyerve etanólos csapadék formájában. A kinyert DNS- ről azt találjuk, hogy mintegy 50 dCMP gyökkel kiterjedt mindkét 3’ terminálisnál. 10 pg pBR 322 DNS-t hasítunk Pstl restrikciós enzimmel és a hasított DNS 3’-terminálisát egyesítjük a dGMP lánccal ugyanazzal a módszerrel, ahogyan azt a dCMP hozzáadásánál ds-cDNS-hez bemutattuk korábban, azzal a kivétellel, hogy dCTP helyett dGTP-t alkalmazunk. (5—4) 50 mmól Tris-HCl puffer (pH 7,5), 0,1 mól NaCl, 5 mmól EDTA, 0,05 pg pBR322 (amelyet dGMP gyökkel meghosszabítottunk) és 0,01 pg cDNS (amelyet dCMP-vel nyújtottunk meg) keverékét először 2 percen át inkubáljuk 65°C hőmérsékleten, majd 120 percen át 46°C hőmérsékleten, majd 60 percen át 37°C hőmérsékleten és végül 60 percen át szobahőmérsékleten. E. coli K 1776 (Curtiss 23 III, R. és munkatársai: Molecular Cloning of Recombinant DNS (szerkesztette: W. A. Scott és R. Werner), Academic Press (1977)) törzset inokulálunk 50 ml L-tápközegben, amely 100 pg/ml diamino-pimelinsavat, 50 pg/ml timidint, 1% triptofánt, 0,5% élesztőkivonatot, 0,5% NaCl-t és 0,1% glükózt tartalmaz, és rázatva inokuláljuk 37°C hőmérsékleten, amíg a tenyésztő tápközeg abszorpciója 562 nmnél mintegy 0,3 O.D (optikai sűrűség) lesz. A tenyésztés befejezése után a tenyésztő folyadékot 0°C hőmérsékleten tartjuk 30 percen át, majd a baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtjük, 25—25 ml oldattal kétszer mossuk, az oldat összetétele: 5 mmól/liter Tris- HCl (pH 7,6), 0,1 mól/liter NaCl, 5 mmól/liter MgCl2 és 10 mmól/liter RbCl. Az így nyert sejteket 20 ml 5 mmól/liter Tris HCl-t (pH 7,6), 0,25 mól/liter KCl-t, 5 mmól/liter MgCl2-t, 0,1 mól/liter CaCl2-t és 10 mmól/liter RbCl-t tartalmazó oldatban szuszpendáijuk és állni hagyjuk 0°C hőmérsékleten 25 percen át, majd a sejteket összegyűjtjük és újra szuszpendáijuk azokat 1 ml fenti oldatban, a fentebb leírt rekombináns DNS-t hozzáadjuk 0,2 ml sejtszuszpenzióhoz és a szuszpenziót 0°C hőmérsékleten 60 percig állni hagyjuk. Ez után 0,7 ml L-tápközeget adunk a tenyészethez, és 30 percig rázatjuk 37°C hőmérsékleten. Az így nyert tenyészet-tápközeget (0,1 ml) alaposan elszéiesztjük egy 1,5%-os agaróz tápközeg felületén, amely 100 pg/ml diamino-pimelinsavat, 50 pg/ml timidint és 15 pg/mi tetraciklint tartalmazó L-tápközegből van összeállítva, és 37°C hőmérsékleten inkubáljuk két napon át. (5—5) Négyszázharminckét feltűnt telepet 18 csoportra osztunk, mindegyik 24 különböző bakteriális kiónt tartalmaz, inokuláljuk 200 ml 100 pg/ml diamino-pimelinsavat, 50 pg/ml timidint és 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-tápközegen és tenyésztjük rázás közben 37°C hőmérsékleten 5—7 órán át. Majd 200 ml friss, klóramfenikolt tartalmazó L-tápközeget 170 pg/ml végső koncentrációval adunk a tenyészethez és tovább tenyésztjük egy éjszakán át. Az így sokszorozott plazmid DNS-t hagyományos módon tisztítjuk. IL-2 cDNS-sel rendelkező kiónokat rostáljuk át mRNS hibridizációs-transzlációs vizsgálattal (a továbbiakban „H-T vizsgálat“). Az itt alkalmazott HT vizsgálatot a következőképpen hajtjuk végre: 25 pg tisztított DNS-t hasítunk el Hind III restrikciós enzimmel, háromszor kezeljük fenollal, majd kezeljük fenol-kloroformmal, illetve kloroformmal, kicsapjuk etanollal, mossuk 80% etanollal és feloldjuk 40 pl 80%-os formamidban. A ~ekciót a denaturálás érdekében 90°C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük, majd hígítjuk a 10XSSC-vel, amelynek összetétele 1,5 mól/liter NaCl, 0,15 mól/liter nátriumcitrát. A DNS-t ezúton rögzítjük nitrocellulóz szűrőre, amely szűrőt 80°C hőmérsékleten 3 órár át szárítottunk, majd 18 órán át 24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
