197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 szennyeződését is az egye heterogén degia dációs termékekkel, ami viszont tisztítási nehézségeket okoz. Az előzőekben ismertetett séma egy másik kivitelezési változata szerint eljárva, ismét a fentiekben ismertetett funkcionális fragmenseket használjuk, de az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát méginkább jobbra haladva építjük be, például a szignál peptid hasítási helye után elhelyezkedő 8. aminosavat meghatározó kodont követően. A szakember számára érthető, hogy ebben az esetben is azonos a funkcionális fragmensek orientációja ezen elemek lipoprotein génben való természetes orientációjával, aminek következtében az ezzel őszszefüggő transzkripciós és transzlációs hatékonyságot ismét előnyösen felhasználhatjuk, fennáll továbbá a négy további hurokszerkezet révén kialakuló növekedett mRNS stabilitás is. Ezen rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia transzkripcióját is transzlációját követően (lásd a 4. ábrát) a fentiekkel azonos folyamat játszódik le, kivéve, hogy transzlációt követően olyan polipeptid keletkezik, amely 20 aminosavból álló szignál pepiidet tartalmaz, ez megfelel a prolipoprotein szignál peptidjének, majd ezután az érett lipoprotein első 8 aminosavának megfelelő 8 aminosavból álló szekvencia következik, és ezután az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája. Ahogy az az előző kivitelezési változat szerint bekövetkezik, ez a prekurzor termék természetes módon áthalad a citoplazma membránon, ennek a folyamatnak a során a szignál peptid felismerődik és lehasad. A termék azonban nem halmozódik fel a periplazmatikus térben, ugyanis a lipoproteinnek megfelelő 8 aminosavat a sejt felismeri, és a kifejeződő termék további folyamatok során a sejt külső membránjába kerüli hasonlóan a lipoprotein külső membránba való természetes elhelyezkedéséhez. Ha, mint ahogy az várható, a kifejeződő terméknek csak a lipoproteinnek megfelelő 8 aminosava kötődik a külső membránhoz, a kifejeződő termék többi része, amely az eukarióta proteinből vagy más, kiválasztott polipeptidből áll, lehasad a külső membránról. A szakember számára ezek után érthető, hogy a fentiekben megadott három beépítési hely egyikét vagy másikát felhasználva felépített plazmid klónozó vektorral, és ennek a plazmidnak a külső géntermékének a kifejezésével a termék elhelyezkedése nagy valószínűséggel előre meghatározható, és könynyen javasolhatjuk a termék izolálására és tisztítására alkalmas módszereket. A beépítési hely kiválasztását gyakran az adott polipeptid identitása és szerkezete határozza meg, különösen abban az esetben, ha a legmegfelelőbb tisztítási módszer az adott termék kapcsán ismert. 17 Több külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav-fragmens a találmány szerinti klónozó hordozókkal való kifejeződésének további elősegítésére egy sor poíinukleotid-szekvencia építhető be mindegyik kifejeződő plazmiddal, olyan szekvenciák, amelyek tartalmazzák az EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzimek felismerő helyeit. Ez további lehetőségeket biztosít, ugyanis hat különböző restrikciós fragmens típus építhető be ily módon mindegyik plazmidba, ismert és az előzőekben megadott módon. A fentiek szerint eljárva, bármely olyan dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst felhasználhatunk, amely az alábbi kohézív végpárokkal rendelkezik: EcoRI-EcoRI, HindlII-HindlII, BamHI-BamHI, EcoRI - -HindlII, EcoRI-BamHI és HindlII-BamHI. Ahogy az előbbiekben megjegyeztük, a genetikai információ kifejeződése indukálható akkor, ha a transzkripció nem kezdődhet el bizonyos molekulák hiányában. Az indukálható génkifejeződés legjobb példája az E. coli lac promoter-operator rendszere, ez a ß-galaktozidáz enzim termelését határozza meg, az enzim a laktóz emésztésében játszik szerepet. Közönséges körülmények között a gén kifejeződése úgynevezett kikapcsolt állapotban van; ezt a laktóz represszor biztosítja. A represszor a lac promoter-operátorhoz kapcsolódik, ezzel lehetetlenné válik a ribonukleinsav-polimeráz és a promoter-szekvencia kapcsolódása, azaz a transzkripció gátolt (és az ezt követő transzláció sem következik be) a ß-galaktozidäz struktürgénen. Laktóz jelenlétében a represszor molekula lehasad a dezoxi-ribonukleinsavról, a gén bekapcsolódik, és lehetségessé válik a transzkripció, amely addig folytatódik, míg megfelelő mennyiségű ß-galaktozidäz enzim termelődik a jelenlévő laktóz emésztésére. Ezután a represszor ismét kikapcsolja a gént. A fentiekben ismertetett konstitutív lpp gén klónozó hordozók indukálhatóvá tehetők oly módon, hogy az lpp promotertől jobbra haladva, de a külső dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmenstől balra, beépítjük az lac promotert. Ezen körülmények között bármelyik promoter által szabályozott külső dezoxi-ribonukleinsav transzkripció a represzszor molekula által gátolva van, és egy adott anyag, a laktóz inducer hiányában nem következhet be. A jelen célokra ez az inducer egy olyan molekula lehet, amely reagál a laktóz represszor molekulával, és ezzel megváltoztatja úgy, hogy a represszor a továbbiakban nem tud kapcsolódni a lac promoter-operator rendszerhez. Laktózzai való indukáláskor (vagy szintetikus inducer, például IPTG jelenlétében) a külső dezoxi-ribonukleinsav transzkripciója mind a lpp, mind pedig, függetlenül az előzőtől, a lac promotertől kiindulva elkezdődhet, amikor körülbelül ötszörös erősségű génkifejeződés következik be, mintha csak a lac promotert használnánk. 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
