197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
Az indukálható lpp gén klónozó hordozók ugyanakkor autoregulálóvá tehetők oly 'módon, hogy mindegyik plazmidba funkcionális E. coli lacl gént építünk be. Ekkor a 1 aktóz represszor gének és a lac promoterek 1:1 aránya az adott polipeptid kifejezésére kiválasztott transzformánsokban megtartható, ez az arány áll fenn a vad típusú E. coli sejtekben is. Ezek a transzformánsok nem kell, hogy tartalmazzák az F’-dezoxi-ribonukleinsavat, ugyanakkor nem alkalmasak arra, hogy az adott termék kifejeződését represszálják azokban a mikroorganizmusokban, amelyeket az E. coli lacl gént nem tartalmazó kifejeződő plazmidokkal transzformáltunk. Érthető, hogy a kifejeződő plazmidok konstitutív és indukálható lpp génjei kapcsán az előzőekben mondottak előnyösen felhasználhatók az autoregulálódó indukálható lpp gént hordozó, és a találmány oltalmi köréhez tartozó kifejeződő plazmidok esetén. Felhasználható az lpp gén négy adott funkcionális fragmenséhez kapcsolódó transzkripciós és transzlációs hatékonyság, a lipoprotein strukturgén terminális részének mRNS transzkripciós termékében jelenlévő négy további hurokszerkezet által biztosított megnővekedett mRNS stabilitás, a külső dezoxi-ribonukleinsav három lehetséges beépítési helyéből adódó lehetőség, arra vonatkozóan, hogy a kifejeződő termék hol helyezkedik el, és a plazmidok külső dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó részébe beépíthető EcoRI, HindflI és BamHI restrikciós enzimet felismerő szekvenciák, amelyek több dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens kifejezését teszik lehetővé. Érthető továbbá az is, hogy gyakorlatilag bármely adott polipeptidet kiféjező struktiirgén kifejezhető a találmány szerinti rekombináns plazmidokkal. Ilyen polipeptid lehet például az emlős és a humán hormonok sora, enzimek és immunogén proteinek (vagy ezek intermedierjei). Ilyen proteinek például az alábbiak: az inzulin A- és B-lánca, a proinzulin, a növekedési hormon, a szomatosztatin, az interferon vagy a trypanosoma antigén, továbbá más termékek. Az alábbiakban a transzformánsokat ismertetjük. Az adott eukarióta proteint vagy más polipeptidet meghatározó gént hordozó autoregulált indukálható rekombináns klónozó plazmidokkal előnyösen speciális E. coli törzseket transzformálunk, és ezekben klónozzuk és fejezzük ki a termelendő proteint. A használt gazdasejtet úgy választjuk ki, hogy az az lpp génben egy deléciós mutációt tartalmazzon, azaz a gazdasejt nem képes a lipoprotein termelésére. Transzformánsként deléciós mutánst használva, valószínűleg stimulálhatjuk az idegen protein termelését. Ezenkívül az idegen protein szekretálódása a citoplazma membránon át az lpp-sérült gazdasejtekben fokozódik, mivel a lipoprotein szekretálódására egyébként felhasznált szekréciós helyek 19 a membránban az idegen protein szekretá'ódására állnak rendelkezésre. Az lpp-sérült sejtek használata különösen akkor előnyös, ha az idegen proteint meghatározó gént a lipoprotein szignál peptidjének hasítási helyére vagy annak közelébe építettük be. Ez azért van így, mivel ezek a sejtek úgynevezett „leaky“ sejtek, azaz a sejtek citoplazma membránján át szekretálódó proteinek kikerülnek a táptalajba a sejt külső membránján áthaladva. Ez valószínűleg nemcsak azért előnyös, mivel az adott idegen protein a táptalajba kerülve egyes esetekben könnyebben izolálható és tisztítható, mintha a sejtben maradna, de azért is, mivel az idegen protein egyébként a periptazmatikus térben halmozódna fel, és ez valószínűleg károsan befolyásolná a sejt normál aktivitását vagy növekedését. Az eukarióta géntermék sejten kívülre történő szekretálódásakor a sejtben közönséges körülmények között jelenlévő proteolitikus enzimek hatása csökkenhet, és a termék nem hasad kis fragmensekre. A következőkben a kísérleteket ismertetjük. A találmány szerinti rekombináns bakteriális plazmid klónozó hordozók egy csoportjának előállítására a fentiekben ismertetett stratégiát és technikákat kísérletesen alkalmaztuk. A teljesség kedvéért a konstitutív és indukálható lpp gént hordozó klónozó hordozók előállításának specifikus kísérleti lépéseit teljes egészében ismertetjük, majd megadjuk azokat a kísérleti lépéseket, amelyek során a találmány szerinti plazmidok egyikét állítjuk elő. Két típusú vagy két családba tartozó hordozót ismertetünk: az egyik konstitutív génkifejezésre alkalmas (pIN-I típusként jelöljük), a másik csoportba az indukálható genkifejezésre alkalmasak tartoznak (ezeket pIN-II jellel jelöljük). A találmány szerinti autoregulált indukálható kifejeződő plazmidokat közös néven pIN-III típusú plazmidoknak nevezzük. A továbbiakban a prolipoprotein szignál peptidjét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül eső beépítési helyet A helylyel jelöljük, azt a helyet, amely a szignál peptid utolsó kodonja után helyezkedik el, B helynek, végül azt a beépítési helyet, amely az érett lipoprotein 8. aminosavát meghatározó kodon után helyezkedik el, C helylyel jelöljük (lásd az 5. ábrát). Mindegyik hely kapcsán három plazmid állítható elő (ezek megfelelnek a három lehetséges leolvasási fázisnak), amikor összesen kilenc ki-fejeződő plazmidot kaphatunk, ezeket A-l, A-2, A-3, B-l, B-2, B-3, C-l, C-2 és C-3 jellel jelöljük. A kísérletek során használt restrikciós enzimeket a New Egland Biolabs. és a Bethesda Research Laboratories-től szereztük be. A T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt ez utóbbi cégtől vásároltuk (kivéve, ha másként adjuk meg), 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
