197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 nál pepiid legnagyobb részét és a lipoprotein gén struktűr-szakaszának egy részét is. A4, ábrán látszik az is (b. rész), hogy a külső eredetű gén 3’-végén kapcsolódik egy extra transzlációs terminációs kodonhoz, ez ugyanakkor a lipoprotein strukturgén megmaradó részéhez kapcsolódik. Ez jobbra haladva szabályosan kapcsolódik az lpp gén 3’-nem transzlatált szakaszához és egy transzkripciót befejező hellyel végződik. Az ábra a. és b. részének összehasonlításakor kiderül az is, hogy a beépített dezoxi-ribonukleinsavat követő funkcionális fragmensek lényegében azonosak azokkal, amelyek közönséges körülmények között a lipoprotein génben szerepelnek. Az lpp génből származó 3’-nem transzlatált régió egy olyan mRNS-szekvenciát kódol, amely képes a 3. ábrán megadott és ott I. számmal jelzett hurokszerkezet kialakítására, és ez — ahogy azt az előbbiekben ismertettük — a lipoprotein mRNS molekulában a legstabilabb másodlagos szerkezet. A 4. ábra b. szakaszán megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia a lipoprotein struktúrgén egy terminális részét is tartalmazza; ez 105 bázispárból áll, a + 168 számmal jelzett bázistól kezdődően (ezt a helyet a 3. ábrán satírozott nyíllal jelöltük). Ezt a szakaszt úgy választjuk meg, hogy az átírt mRNS stabilitása tovább növekedjen a négy további hurokszerkezet kialakulásával (ezt a 3. ábrán If., III., IV. és V. számokkal jelöltük), anélkül, hogy á termelt mRNS molekula nagysága túlzottan megnőne. Ahogy azt az alábbiakban tárgyaljuk, ez a szakasz gyengén transzlatálódik. A 4. ábra b. részén megadott rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia transzkripcióját követően egy olyan mRNS-szekvencia jön létre, amit a 4. ábra c. részén ábrázolunk. Látható, hogy a szekvencia tartalmazza az 5’-nem transzlatált szakaszt és a 3’-nem transzlatált régiót; mindkettő közönséges körülmények között kapcsolódik a lipoprotein termeléséhez. Az mRNS ugyanakkor az eukarióta proteint meghatározó szakaszt is tartalmazza, előtte a lipoprotein szignál peptidjének egy rövid szegmensét leíró szakasz látható, és utána pedig egy további szakasz, amely a lipoprotein egy szegmensét határozza meg. Ez utóbbi szakasz valójában nem transzlatálódik, mivel az eukarióta struktúrgén 3’-végénél egy terminációs kodon épült be (ezt a 4. ábra b. és c. helyein nyíllal jelöljük). Transzlációt követően olyan polipeptid keletkezik, amely több többlet aminosavat tartalmaz, majd — ezek után — az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája következik (lásd a 4. ábra d. részén). Ez a konjugált kifejeződő termék a sejt citoplazmáján belül halmozódik fel, mivel a szekretálódás nem következhet be a teljes szignál peptid hiányában. Bizonyos proteinek esetén a kifejeződő termék ismert módon izolálható a ci-15 toplazmából, és a felesleges protein fragmens ezután a természetes protein termékről ismert módon lehasítható és eltávolítható (lásd a 4. ábra e. részét), amiután felhasználásig tárolható adott polipeptidet kapunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a felesleges aminosavakat kódoló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a baktériumsejt transzformációja előtt ismert módon kihasítjuk a kifejeződő plazmidból, ekkor a kifejeződő termék pontosan megfelel a számunkra kívánatos külső eredetű proteinnek, amit azután ismert módon tisztíthatunk. A találmány szerinti következő előnyös kivitelezési változat szerint a fentiekkel azonos funkcionális fragmenseket használunk, azonban az adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát jobb felé haladva építjük be, a szignál peptid utolsó kodonja után (azaz a szignál peptid hasítási helyére, vagy ahhoz közel). A szakemberek számára érthetően, ebben az esetben is azonos a funkcionális fragmensek orientációja ezen elemek lipoprotein génben meghatározott természetes orientációval, azaz az ezekkel együttjáró transzkripciós és transzlációs hatékonyság fennmarad, ugyancsak megmarad az előzőekben ismertetett, és az mRNS másolat stabilitását biztosító négy további hurokszerkezet. Egnnek a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciának a transzkripciója és az ezt követő transzláció a fentiekkel és a 4. ábrán megadottakkal azonos módon történik, azzal a különbséggel, hogy a transzlációt követően a prolipoprotein szignál peptidjének megfelelő szignál pepiidet tartalmazó polipeptid jön létre, ezután pedig az adott eukarióta protein aminosav-szekvenciája következik. Ez a prekurzor termék átléphet a citoplazma membránon, ezt a szignál peptid szabályozza, a folyamat során a peptid hosszúsága nő, és ezután az E. coli transzformáns sejtek számára természetes enzimes reakcióval ez a rész lehasad, amiután a természetes eukarióta proteint tartalmazó termék keletkezik, talán néhány, az amino-terminális. véghez kapcsolódó extra aminosavval együtt, amelyeket a fentiekben megadottak szerint eljárva lehasíthatunk. Ez a termék túlnyomórészben a periplazmatikus térben halmozódik fel, és átléphet a külső membránon át a táptalajba, akkor, ha bizonyos, a továbbiakban részletesen ismertetett E. coli transzformáns törzseket használunk. Ha a fentiek szerint járunk el, a sejten belül felhalmozódó nagymennyiségű kifejeződő termék valószínűleg kevéssé hat a sejt növekedésére, mivel az eukarióta fehérje egy, a sejt számára természetes szignál pepiiddel van kapcsolva. Ugyanakkor a szignál peptid jelenléte védheti a külső eredetű fehérjét a sejten belüli degradációs hatásoktól, amelyek egyébként a fehérje hozamát csökkenthetik, és okozhatják a külső protein 16 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
