197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 génjén lévő promoter szakasz adenin-timin tartalma igen magas (78%), ahogy azt az E. coli lipoprotein gén esetében is tapasztaltuk (80%). Ezenkívül, bár az S. marcescens prolipoproteinjének szignál peptid-részét meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia részben különbözik az E. coli-étől, az aminosav-szekvenciában megfigyelhető változások nem változtatják meg a szignál peptid alapvető tulajdonságait, mint amiket az E. coli prolipoproteinjénél megadtunk, és amelyek más bakteriális szekretálódó proteineknél is léteznek. Az S. marcescens lipoprotein mRNS, ahogy a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciából adódik, 7 stabil „hajcsat“-szerkezetet képes kialakítani. A lipoprotein különböző Gram-negatív festődésű baktériumnál képződik, és megfigyelték, hogy az E. coli lipoprotein mRNS hibridizálódik legalábbis az alábbi 7 baktériumfaj (az S. marcescens-en kívül) dezoxi-ribonukleinsavával: az Enterobacteriaceae családon belül: Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium, Citrobacter freundii, Klebsiella aerogenes, Enterobacter aerogenes, Edwardsiella tarda és Erwinia amylovora, ez bizonyítja a lipoprotein gén homológiáját E. coli és más Gram-negatív festődésű baktériumok között. A találmány oltalmi körének kiterjesztését az analóg és bármely Gram-negatív festődésű baktériumból származó igen hatékony génkifejeződési mechanizmust használó rekombináns plazmid klónozó hordozókra a fentiek és más eredmények alapján értelemszerűleg találjuk. A Gram-negatív festődésű baktériumok külső membrán proteinjeinek jellegzetes bioszintézise a lipoprotein géneket és más, külső membrán protein géneket igen használható alannyá teszik abból a szempontból, hogy bakteriális transzformánsokban lévő külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmensek kifejeződését szabályozzuk. A leírás során több ilyen klónozó hordozó szerkezetét és funkcióját adjuk meg. Az alábbiakban ismertetjük a génkifejezés stratégiáját. Az előzőekből kiderül, hogy az E. coli lipoprotein génjének hatásos transzkripciójáért és transzlációjáért felelős részek a gén funkcionális fragmensein helyezkednek el, nevezetesen a promoter, az 5’-nem transzlatált szakasz, a 3’-nem transzlatált szakasz és a transzkripciós terminációs hely, amelyek, ahogy azt a 4. ábra a. betűvel jelölt részén látjuk, az lpp struktúrgéntől vagy jobbra vagy balra haladva helyezkednek el. Egy eukarióta proteint vagy más, megfelelő pepiidet meghatározó struktúrgént az előző funkcionális fragmensek kombinációját tartalmazó kifejeződő plazmidba való beépítésével és ennek a plazmidnak egy baktériumsejtbe való transzformálásával elérhetjük, hogy a struktúrgén transzkripciója és az ezt követő transzláció ezen funkcionális fragmensek szabályozása alatt menjen végbe. 13 8 A szakemberek számára érthető okokból, különösen előnyös az, ha az előzőekben említett funkcionális fragmenseket együttesen, tandem formában egyetlen kifejeződő plazmidon használjuk fel. Azzal, hogy az adott polipeptid struktdrgénjét ennek 5’-végén hozzákapcsoljuk az E. coli lpp gén promoterét és 5’-nem transzlatált szakaszát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciához (ez a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia előnyösen tartalmazza a transzkripció kezdetét meghatározó jelet követő 260 bázispárból álló teljes A-T gazdag dezoxi-ribonukleinsav-szegmenst is) igen hatékony transzkripciót érünk el, mivel az egyik legerősebb baktérium promoted használjuk, ugyanakkor a transzláció is igen hatékony, mivel olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát használunk, amely meghatározza a transzláció kezdetét, és a leghatásosabb riboszóma kötőhelyet. Ezenkívül, ha a struktürgént ennek 3’-végén hozzákapcsoljuk az E. coli lpp gén 3’-nem transzlatált szakaszát és a transzkripciós terminációs jelet hordozó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciához, a transzkripció hatékonysága valószínűleg tovább fokozódik, mivel kiküszöbölődik a transzkripciós átolvasás (az mRNS szükségtelenül hosszú 3’-nem transzlatált szakaszának szintézise), és ami még fontosabb, fokozódik az mRNS termelés mértéke. Az mRNS molekula stabilitása szintén biztosítva van azzal, hogy létrejön a 3’-nem transzlatált szakasz másodlagos szerkezete. Ahogy azt az alábbiakban részletesen megadjuk, a lipoprotein szekretálódó termeszeiét felhasználhatjuk egy eukarióta protein vagy más, adott polipeptid kifejeződésének más szempontok szerinti szabályozására, nevezetesen arra, hogy a kifejeződő termék hol legyen megtalálható. A külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav lpp génbe való beépítésének helyétől függően a kifejeződő termék vagy a transzformáns sejt citoplazmáján belül a periplazmatikus térben, vagy a sejt külső membránjában helyezkedik el. A 4. ábrán vázlatosan szemléltettünk egy olyan folyamatot, amelynek során egy transzformáns mikroorganizmus kifejez az előzőekben megadott séma szerint egy természetes eukarióta proteint. A 4. ábrán szemléltetett egyedi eset során az eukarióta protein struktdrgénjét az lpp gén szignál peptidjét meghatározó szakaszába építettük be, több bázissal a transzlációs iniciációs kodon után, és jobbra haladva bizonyos funkcionális fragmensektől (nevezetesen, a promotertől és az 5’-nem transzlatált szakasztól), ezek közönséges körülmények között a lipoprotein génhez kapcsolódnak. A 4. ábra a. és b. betűkkel jelölt részének összehasonlításakor kiderül, hogy ezen funkcionális fragmensek orientációja azonos ezen elemek lipoprotein génben való természetes orientációjával, ugyanakkor a külső eredetű dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens helyettesíti a szig14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
