197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 bázispárig egy dodekanukleotid-szekvenciát, ez pedig homológ az általános érvényű ribonukleinsav polimeráz felismerő hellyel. Ezen szekvenciák homológiája meglepő abban, hogy az lpp promoter Pirbnow-box-szekvenciája csak egyetlen bázispárban tér el az általános érvényű szekvenciától, míg a felismerő hely szekvenciája a 12 általános érvényű bázis-szekvenciától csak 5 helyen tér el. Ezen specifikus bázis-szekvenciák ezen a helyen, ahogy az jól ismert, rendkívül fontos szerepet játszanak a hatékony transzkripcióban, ugyanis megnövekedett promoter hatékonysággal rendelkező mutánsok ezeken a helyeken fokozottab homológiát mutatnak az általános érvényű szekvenciákkal. Az 1. ábrán megadott dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia további analízis során kiderül, hogy az igen „erős“ promoter jelenléte mellett a lipoprotein gén egy oligó-T transzkripciós terminációs szignállal is rendelkezik; ez a +316 és 4-322 bázispárok között helyezkedik el, és ez legalább olyan hatékony, mint más — vizsgált — E. coli transzkripciós terminációs helyek. Valószínű, hogy ez a tényező hozzájárul a transzkripció igen nagy hatékonyságához, oly módon, hogy meghatározza az mRNS termelést, és korlátozza a dezoxi-ribonukleinsavról átírt mRNS molekula nagyságát. Ahogy az a 2. ábrán látható, az E. coli lipoprotein mRNS teljes nukleotid-szekvenciája ismert, kiderül, hogy az niRNS több olyan különleges tulajdonsággal rendelkezik, amely fontos az mRNS hatékony transzlációjához. Az mRNS 322 nukleotidból áll, 38 az 5’-nem transzlatált régión és 50 a 3’-nem transzlatált régión helyezkedik el; a többi 234 transzlatált nukleotid meghatározza a prolipoproteint, a lipoprotein prekurzorát. A 2. ábrán megadott mRNS-szekvencia komplementer az 1. ábrán ismertetett dezoxi-ribonukleinsavszekvenciával; egyetlenegy kivétellel: a 313. nukleotid a 2. ábrán citozin (ezt ribonukleinsav-szekvenálással határoztuk meg), míg az 1. ábrán a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenálás szerint adenin. E különbség oka jelenleg még nem ismert. A lipoprotein mRNS szokatlanul stabil, úgy gondolják, hogy ez a stabilitás valószínűleg a molekulán belül kialakuló extenzív másodlagos szerkezetnek tulajdonítható. Ahogy az a 3 ábrán látható, az mRNS 9 stabil, úgynevezett „hajcsat“ szerkezetet képes kialakítani (ezt az ábrán I—IX. számokkal jelöljük), ezek közül a legstabilabb (I) a 3’-nem transzlatált szakaszon helyezkedik el. Ez a másodlagos szerkezet felelős lehet a hosszú funkcionális felezési időért, amit más E. coli mRNS molekulákkal összehasonlítva a lipoprotein mRNS esetén tapasztalhatunk, így ez lehetővé teheti a riboszómális transzlációkor rendelkezésre álló molekulák számának növekedését. 11 Bár az mRNS molekulában jelenlévő öszszes nukleotid 68%-a részt vesz a „hajcsat“-szerkezet kialakításában (lásd a 3. ábrát), megjegyzendő, hogy az 5’-végtől számítva az első 64 nukleotid nem alakít ki ilyen szerkezetet; ugyanakkor a 65. nukleotid és a 3’-vég közötti nukleotidok 85%-a kialakítja ezt a szerkezetet. Ez fontos, mivel az 5’-nem transzlatált szakaszon (4-1-tői +38. nukleotidig) két kiterjedt, ismétlődő nukleotid-szekvencia helyezkedik el, ezek valószínűleg meggátolják ezen szakaszon belül a szekunder szerkezet kialakulását, és lehetővé teszik a ríboszóma kötőhely és a riboszómák kapcsolódását, ezzel elősegítvén a transzláció kezdetét. A transzláció elkezdése ezenkívül valószínűleg tovább erősödik azzal, hogy a molekula ezen szakaszában két lehetséges riboszóma kötőhely helyezkedik el. Végül, az mRNS 3’-nem transzlatált szakaszán mindhárom transzlációs terminációs kodon jelen van (UAA a +273 — +275 helyen, UAG, +276----1-278. helyen és UGA a a +285 és +287. bázispár között; lásd a 2. ábrát), mindhárom-hasonló leolvasási fázisban van, mint a transzlatálható vagy kódoló szakasz, ezzel egy egyedülálló tandem terminátor alakul ki, ami valószínűleg hozzájárul a hatékony transzlációhoz azzal, hogy a transzláció megfelelő terminációja biztonságosan bekövetkezik. Ezen fenti tények kumulatív hatása és a lipoprotein mRNS más egyedülálló tulajdonságai eredményezik valószínűleg az E. coli sejtekben ennek a genetikai információnak az igen hatásos transzlációját. A fentiekben ismertetett hatásos kifejeződésen túlmenően, az E. coli lipoprotein más fontos tulajdonsága az, hogy az egy szekretálódó protein, azaz egy prekurzorból jön íétre, ez a prekurzor a citoplazma membránon áthaladva lipoproteinné alakul. így a lipoprotein mRNS transzlációjakor valójában egy prekurzor molekula jön létre, ezt prolipoproteinnek nevezzük, ennek egy peptid-része vagy szignál peptid-része 20 aminosavból áll, és amino-terminális végen helyezkedik el; ennek szekvenciáját meghatározták. Ezután követkeT zik a lipoprotein ismert 58 aminosava. Bár a szekretálódás mechanizmusai nem teljesen ismertek, a szignál pepiid valószínűleg az in vivo transzlokációt szabályozza a citoplazma membránon át, abban a folyamatban, amikor a szignál peptid-rész lehasad, és érett lipoprotein jön létre. Valószínű, hogy hasonló folyamatok játszódnak lé az összes Gram-negatív festődésű baktérium nagy külső membrán proteinjeinek keletkezésekor. így például a Serratia marcescens lipoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának és az E. coli lipoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciájának analízisekor és összehasonlításakor kiderült, hogy a promoter szakasz 84%-os, és az 5’-nem transzlatált szakasz 95%-os homológiával rendelkezik. Az S. marcescens lipoprotein 12 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
