197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 biakban magyarázzuk, a mellékelt ábrákkal együtt: az 1. ábrán vázlatosan megadjuk az E. coli lipoprotein gén 814 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját, a transzkripciós és a terminációs jeleket háromszöggel jelezzük. Bemutatjuk az ábrán a 78 aminosavból álló prolipoprotein szekvenciát is, ezt a dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciából vezettük le, és a dezoxi-ribonukleinsav megfelelő kodonjai alá írtuk. A 2. ábrán bemutatjuk az E. coli lipoprotein mRNS teljes 322 nukleotidból álló szekvenciáját, jelöljük az mRNS-szekvenciából levezetett prolipoprotein aminsav-szekvenciáját is, ezt a nukleotid-szekvencia megfelelő kodonjai alá írtuk. A 3. ábrán az E. coli lipoprotein mRNS másodlagos szerkezetét mutatjuk be, a transzlációs iniciációs kodont bekereteztük. A 4. ábrán sematikusan mutatjuk be azt az eljárást, amellyel a találmány szerinti klónozó hordozók segítségével egy eukarióta protein vagy egy más polipeptid kifejezhető, a transzkripció kezdetét és végét meghatározó szakaszt nyilakkal jelöljük, a transzláció kezdetét és végét meghatározó helyeket üres nyilakkal adjuk meg. Az 5—27. ábrákon sematikusan szemléltetjük a találmány szerinti rekombináns plazmid klónozó hordozó előállításának módszereit, az ábrákon megadjuk a különböző restrikciós endonukleázok hasítási helyeinek relatív helyzetét; az AmpR és a Tcr sorrendben az ampicillin és tetraciklin rezisztenciát jelöli. A 28. és 29. ábrákon sematikusan szemléltetjük az 5—27. ábrákon megadott módon előállított plazmidok egyikének előnyös módosítási módszerét, amiután megkapjuk a találmány szerinti egyik plazmidot. Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti eljárás legelőnyösebb kivitelezési változatát. Az eddig ismert kutatási eredmények öszszefoglalása: A jelen kutatások azt jelzik, hogy a Gram-negatív baktériumok legnagyobb külső membrán proteinjei mindegyik baktériumsejtben nagy mennyiségben vannak jelen. Ügy találták, hogy az egyik legintenzívebben vizsgált membrán protein, az E. coli lipoprotein a sejtben jelenlévő proteinek közül az egyik legnagyobb mennyiségben jelenlévő molekula: körülbelül 700—750-ezer lipoprotein molekula van egyetlen sejtben. Továbbá úgy találták, hogy az E. coli lipoproteinjének csak egyetlen struktúrgénje létezik, így mind transzkripciós, mind pedig transzlációs szinten különösen hatékonyan működő rendszer kell, hogy létezzen. 9 6 Az a vélemény alakult ki, hogy a lipoprotein gén legalább tízszer hatékonyabban fejeződik ki, mint a riboszómális proteinek génjei.Ugyancsak jelentős mennyiségben vannak jelen más, nagyméretű külső membrán proteinek az E. coli-ban, mint például az ompA protein, és ugyancsak nagy mennyiségben léteznek a Serratia marcescens sejtekben a nagyméretű külső membrán proteinek, mint például a lipoprotein. Mindez azt jelenti, hogy ezen rendszerekben a génkifejeződés szintén igen hatékony. Bár jelen leírásban elsősorban az E. coli lipoprotein rendszeréről beszélünk, érthető módon a találmány olyan rekombináns klónozó hordozókra is vonatkozik, amely bármely Gram-negatív festődésű baktérium bármely külső membrán proteinjének génkifejeződésével van összefüggésben. Bár ez igen hatékony E. coli lipoprotein génkifejeződés mechanizmusa nem teljesen ismert, az a vélemény alakult ki, hogy több tényező hozzájárul a baktériumsejtben lévő lipoprotein molekulák nagy számának szintézisében. Ahogy az az 1. ábrán látható, az E. coli lopoprotein gén dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciáját meghatározták, így nyilvánvalóvá vált, hogy több egyedülálló tulajdonság függ össze ezen gén kifejeződésével. Elsősorban az látszik, hogy az E. coli gének más ismert promoter szekvenciájával összehasonlítva, a lipoprotein promoter régió különleges abból a szempontból, hogy igen magas az adein-timin tartalma; ez valószínűleg alapvető fontosságú a lipoprotein gén rendkívül hatékony transzkripciójához. A transzkripció kezdetét meghatározó helyet megelőző 261 bázispárból álló szegmens (a —261-től a —1 bázispárig terjedő rész; lásd az 1. ábrát) igen magas, 70% adenin-timin tartalmú, ugyanakkor, az átírt szakasz (vagy mRNS szakasz) 322 bázispárból álló része (-(-1-től +322 bázispárig) 53%, a transzkripció leállását meghatározó szakasz (+323-tól +449 bázispárig) 126 bázispárból álló része 44%, és az E. coli kromoszóma átlagosan 49%-os adenin-timin tartalpiú. A —45 — —1 helyzetű szegmens adenin-timin tartalma különösen magas, 80%; itt helyezkedik el a lipoprotein (lpp) promoter vége. Ez a %-os összetétel legmagasabb az eddig ismert E. coli promoterekkel öszszehasonlítva. A promoter-szekvencia adeninben és timinben való gazdagsága valószínűleg destabilizálja a dezoxj-ribonukleinsav hélix-szerkezetét, és ezzel a transzkripció kezdetéhez szükséges, a ribonukleinsav-polimeráz által szabályozott szálkicsavaro'dást elősegíti. Az lpp promoter adenin-timin tartalmán túlmenően, a —15 — —9 terjedő szakaszon (ez csak 8 bázispárnyi távolságban van a transzkripció kezdetét meghatározó helytől) égy heptanukleotid szekvenciát tartalmaz; ez homológ az általános érvényű Pribnow-boxszal, tartalmaz továbbá a —38 — —27 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
