197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 lévő egy lacZ gén represszálva legyen. Ugyanakkor ez nem elegendő egy indukálható kifejeződő plazmidba klónozott külső dezoxi-ribonukleinsav kifejeződésének gátlására, mivel 10—20 klónozó hordozó létezhet egy adott időpontban mindegyik sejtben, és mindegyik tartalmaz egy aktív lac promotert. Ezért nagyobb mennyiségű laktóz represszor szükséges, és így transzformációhoz előnyösen egy speciális E. coli törzset használunk, a JA221/F’ lacl*lac+ pro+ mutánst, ez hordozza a mutáns lacF gént. A lacF gén az lacl mutánsa, ez utóbbi a laktóz represszort meghatározó normális gén. A mutáns gén túltermeli a laktóz represszort, egy adott időpontban 100—150 molekula/sejt koncentrációt biztosít. A lacl’ gén az F plazmidon helyezkedik el ebben az E. coli törzsben. Az a tény, hogy a jelen módszer szerint a transzformánsokban az adott polipeptid kifejezéséhez olyan sejtekre van szükségünk, amelyek az F plazmidot hordozzák, bizonyos hátrányokkal jár. Mindenekelőtt az indukálható kifejeződő plazmid recipiense (befogadó sejtje) olyan E. coli törzs kell, hogy legyen, amely hordozza a lacl’ gént, mivel ennek a génnek a hiányában a sejt nem termel elegendő mennyiségű laktóz represszort, és így folyamatosan kifejeződik az adott termék. Másodszor, az F plazmid egy szex faktor; ez konjugációra készteti az E. coli sejteket, aminek következtében az F plazmid egyik sejtből átjut a másikba. Ezt a faktort hordozó E. coli törzseket eukarióta gén klónozására felhasználnunk nehézkes, ezért a módszer felhasználhatósága tovább csökken. Végül, mivel általában sejtenként 2 vagy 3 F plazmid-másolat létezik (mindegyikük 100—150 laktóz repressor molekulát határoz meg), és mivel mindegyik sejt az indukálható kifejeződő plazmidból is tartalmaz 10- 20 másolatot (mindegyik hordoz egy funkcionális lac promotert), a represszor molekulák aránya a lac promoterekéhez sejtről sejtre széles határok között változik, és — egyes esetekben — ném következik be az adott kifejeződő termék teljes repressziója. A találmány szerinti eljárás célja olyan új plazmid klónozó hordozó előállítása, amelyek nem rendelkeznek a fenti hátrányokkal. A találmány szerinti eljárás értelmében úgy járunk el, hogy előállítunk olyan külső gének transzformált baktérium gazdasejtben való kifejezésére alkalmas rekombináns bakteriális plazmid klónozó hordozókat, mindegyik plazmid egy adott polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst tartalmaz, egy vagy több olyan funkcionális fragmenshez kapcsolva, melyek egy Gram-negatív festődésű baktérium külső membrán protein génjéből származik, és kapcsolva leolvasási fázisban tartalmaz egy indukálható promoter fragmenst is. Mindegyik plazmid tartalmaz egy olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát is, amely meghatároz egy, az 7 indukálható promoter fragmenshez kötődni képes proteint, és ezzel represszálja a transzkripciót. Egy előnyös kivitelezési változat szerint a funkcionális fragmensek az E. coli lipoprotein génjéből származnak, az indukálható promoter fragmens az E. coli lac promoterje, a represszort meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia egy intakt, funkcionális E. coli lacl gén, és az adott polipeptidet E. coli transzformánsokban fejezzük ki. Három csoportba osztható plazmidot állítunk elő, mindegyikük a három alternatív beépítési hely egyikét tartalmazza. Ily módon egy adott plazmid vagy egy adott plazmidcsoport szelektálásával meghatározható a gén kifejeződését kővetően az a tényleges hely, ahonnan a kifejeződő termék izolálható. A beépíthető helyek egyikét használva például az adott polipeptid egy olyan vezető szekvenciával együtt fejezhető ki, amely az amino-terminális véghez kapcsolódik, és amely tartalmazza az E. coli lipoprotein szignál peptidjét, ily módon az adott termék átléphet a citoplazma membránján, és a szignálpeptid a transzformáns számára természetes folyamattal in vivo lehasítását követően megkapjuk a külső gén által meghatározott terméket. Ha a másik két beépíthető hely egyikét vagy másikát használjuk fel, úgy a kifejeződő termék vagy a citoptazmában, vagy a sejtfalban halmozódik fel. Mindegyik alcsoportba tartozó plazmid egy közönséges beépítési hellyel rendelkezik, azonban egymástól a leolvasási sémában különböznek. így mindegyik alcsoport 3 plazmidot reperezentál, ezek leolvasási sémája egy bázispárban különbözik, ezzel lehetségessé válik mindegyik beépíthető hely szempontjából bármilyen kívánt leolvasási séma kiválasztása, és ezzel fokozódik a találmány szerinti eljárás felhasználhatósága nagyszámú dezoxi-ribonukleinsav beépített fragmens kifejezésére anélkül, hogy ezeknek a fragmenseknek a leolvasási fázisát közvetlenül módosítanunk kellene. Egy adott polipeptidet leíró külső dezoxiribonukleinsav a találmány szerinti plazmidokban csak akkor fejeződik ki, ha laktóz inducer van jelen. Laktóz inducer hiányában a klónozott gén transzkripciója teljesen represszált, mivel a gazdasejtben jelenlévő kifejeződő plazmid mindegyik másolatában jelen van egy lacl gén. így indukálható génkifejeződés valósítható meg a klónozó hordozók használatával, anélkül, hogy F plazmidot hordozó transzformánsokat használnánk. A találmány szerinti klónozó hordozók genetikai információjának kifejeződését az egyes plazmidokon belül szabályozzuk, így a gén kifejeződése autoregulált. A továbbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat. A találmány szerinti géntermékek, például a humán inzulin bakteriális transzformánsok kifejezésére alkalmas rekombináns baktérium plazmidok szerkezetét és funkcióját az aláb8 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
