197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 gázzal kezeljük (az enzimet a New England Biolabs-tól szereztük be). A reakciót 25 ni ligáz-pufferban végezzük, amelyhez 0,48 mmól/l adenozin-trifoszfátot adunk. A reakcióhőmérséklet 12,5°C, a reakcióidő 16 óra. 15 pl ligációs eleggyel E. coli W620 recA, NRRL B-15024 (F-, thi-1, pyrD36, gltA6, galK30, strA129- lambda-, supE44) törzset transzformálunk. A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A törzs az E. coli W620 törzsből származik, amelyet az alábbi intézettől kaptunk: Department of Human Genetics, Yale University, School of Medicine. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok egyikéből izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsav szerkezetét a 28. ábra 150. számmal jelölt helyén mutatjuk be. Ezt a plazmidot pYM051 (NRRL B-15025) jellel jelöljük, a törzs a fentiekben megadott törzsgyűjteményben van letétbe helyezve. A plazmidot az NRRL B-15025 sejtekből ismert módon izoláljuk. 2) A pYM052 és pYM053 plazmidok előállítása A pYM051 plazmid olyan 5,1 kb nagyságú Pstl-EcoRI dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst hordoz, amely nemcsak a lacl gént tartalmazza, de hordozza a lacZ gén jelentős részét is. A 28. ábra 160. jellel jelölt részén bemutatjuk, hogy ez a fragmens 3 Hindi hasítási helyet tartalmaz a lacl gén szomszédságában, kettő ezek közül körülveszi a lacl gént és az egyik, a lacl génen belül helyezkedik el. Az 5,1 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmens rövidítésére, és ugyanakkor a lacl intaktságának megőrzése érdekében az alábbiak szerint járunk el: 5 pg pYM051 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat részlegesen emésztünk 0,32 egység Hindi restrikciós enzimmel, 75 pl HindlII-pufferban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat csökkentett nyomású térben szárítjuk. A hasítás során különböző hosszúságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket kapunk; ezek egyike hordozza az érintetlen lacl gént (1,7 kb hosszúságú, vertikális és horizontális csíkozással szemléltetjük a 28. ábra 160. számmal jelzett helyén). A rövid, de a lac.I gént hordozó molekula előállítására egy pYMlll jellel jelölt plazmidot állítunk elő. Ez a plazmid az E. coli JA221/F’lacIVpYMlll törzsből (NRRL B-15038) állítható elő. A törzs az alábbi törzsgyűjtemény része: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A plazmid az NRRL B-15038 törzsből ismert módon izolálható. Ahogy azt a 28. ábra 161. számmal jelzett helyén sematikusan bemutatjuk, a pYMlll egy Hpal hasítási helyet tartalmaz, viszonylag közel a két EcoRI hasítási helyhez. Ez a plazmid alkalmas recipiens a lacl 51 gén fragmens számára, mivel tagja az alábbi tulajdonságokkal rendelkező plazmid-osztálynak: 1) tartalmaz egy egyedülálló restrikciós enzimmel hasítható helyet (azaz egy olyan helyet, amely csak egyszer fordul elő a plazmidban), aminek hasításakor tompa végek képződnek, mint például Hpal, Hindi vagy PvuII; 2) a pBR322 plazmidból származik, és az egyedülálló hasítási hely nem azon a dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül fekszik, amely felelős a plazmid replikációjáért; 3) tartalmaz továbbá két, az egyedülálló hasítási helyet körülvevő, restrikciós enzim által felismerhető szakaszt, ez az egyedülálló hasítási hely 400—700 bázispárból álló részén belül helyezkedik el. A két szomszédos hasítási helyet hasonló, könnyen hozzáférhető restrikciós enzim ismeri fel, mint például az EcoRI, HindlII, BamHI vagy a Pstl. Ugyanakkor a két szomszédos hasítási hely egyike sem ismétlődik a lacl génen belül. A pYMlll plazmid előnyös azért is, mert csak egy Hpal hasítási helyet tartalmaz a két EcoRI hasítási hely körül elhelyezkedő 400—700 bázispáron belül, és azért is, mivel a lacl gén maga nem tartalmaz EcoRI hasítási helyeket. Érthető ugyanakkor, hogy bármilyen plazmidot felhasználhatunk a lacl génfragmens beépítésére, amelyek a fenti tulajdonságokkal rendelkeznek, és amelyek a találmány szerinti eljárás további lépései során ennek a génfragmensnek a forrásaként használhatók. A lacl gént hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst beépítjük a pYMlll plazmidba, ahogy azt a 28. ábra 162. jellel jelölt helyén sematikusan ábrázoljuk. Úgy járunk el, hogy 4 pg pYMlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 4 egység Hpal restrikciós endonukleázzal kezelünk 50 pl Hpal-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. Fenolos extrakciót követően etanolos kicsapással különítjük el a dezoxi-ribonukleinsavat, amit csökkentett nyomású térben szárítunk. A Hpal-kezelt dezoxi-ribonukleinsav-íragmensek önmagukkal való kapcsolódásának meggátlására a száraz dezoxi-ribonukleinsavat 0,15 egység DAP-val kezeljük 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 10 mmól/l trisz-hidrogén-klorid (pH=8,0) és 0,1 mmól/l etilén-diamin-tetraecetsav. (Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban BAP-puffernak nevezzük.) A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 45 percen át. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenolos extrakciót végzünk, ezután etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Az intakt lacl gént hordozó 1,7 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmens pYMl 11 plazmidba való beépítésére 0,1 pg Hpal enzimmel kezelt pYMlll plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 0,275 pg olyan dezoxi-ribonuk-52 27 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
