197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 leinsav-fragmensekkel keverünk, amelyet a pYMOöl plazmid részleges Hindi emésztésével kaptunk. A dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat 320 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal (New England, Biolabs.) kapcsoljuk 20 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. A ligációs elegy felével E. coli W620 recA törzset (NRRL B-15024) transzformálunk, és a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint és 40 pg/ /ml 5-br0m-4-klör-3-indolil-ß-D-galaktozidot (a továbbiakban: X-gal) tartalmazó L-táptalaj felületére juttatjuk. A fehér telepeket fejlesztő transzformánsokat szelektáljuk, ez a szín azt jelenti, hogy a pYMlll plazmidba ebben az esetben beépült a teljes lacl gént hordozó, 1,7 kb nagyságú Hindi fragmens. Mivel a transzformáció során kapott plazmidokban a lacl gén két orientációban épül be, a kapott plazmid-típusokat pYM052 és pYM053 jellel jelöljük. A két plazmid szerkezetét a 28. ábra 163. számmal jelzett helyén mutatjuk be. 3) A pYM058 plazmid előállítása A kifejeződő plazmid nagyságának további csökkentése érdekében, és a lacl gén kifejeződését gátló bármely lehetséges hatás eliminálására (ez a plazmidban még mindig jelenlévő lacZ génrészlet jelenlétéből adódhat) a lacZ génfragmenst eltávolítjuk, ugyanakkor biztosítjuk a lacl gén sértetlenségét. A fragmensnek a pYM053 plazmidból való eltávolításának stratégiáját a 29. ábrán sematikusan ábrázoljuk. A 29. ábra 164. számmal jelzett helyén szemléltetjük, hogy a lacl gént tartalmazó pYM053 plazmid két EcoRI hasítási helye között milyen a részleges restrikciós térkép. Ez a szakasz tartalmaz a fentiekben, a 28. ábra magyarázata kapcsán és a 28. ábra 157. és 160. számmal jelzett helyével kapcsolatban elmondottak szerint három Hindi hasítási helyet. Ahogy azt a 29. ábrán bemutatjuk, ezen Hindi helyek közül kettő a Hpal restrikciós endonukleáz által is felismerhető. Ezenkívül, a 29. ábrán ábrázoltak részletesebb vizsgálatakor kiderül, hogy ezen a szakaszon három Mspl hasítási hely is létezik, ezek közül kettő a lacZ génfragmensen belül helyezkedik el, egy pedig a lacl gént a lacZ génfragmens 5’-végétől elválasztó dezoxi-ribonukleinsav-szekvencián belül esik. A fenti elrendeződés lehetővé teszi a két Hpal hasítási hely közötti 789 bázispárból álló fragmens könnyű izolálását. A fragmens tovább osztható Mspl fragmensek előállításával, ezek közül egy a lacl gén 3’-szakaszát tartalmazza, de nem hordozza a lacZ gén egyetlen részét sem. Ezt a fragmenst később megfelelő orientációba visszaépíthetjük, amiután újra megkapjuk az érintetlen lacl gént. Ügy járunk el, hogy 100 pg pYM053 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 60 egység Hpal 53 28 restrikciós enzimmel kezelünk 800 pl Hpalpufferban, 2 órán át, 37°C hőmérsékleten. 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk a 789 bázispárból álló fragmenst, a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket a poliakril-amid ^élen 1 pg/ml koncentrációjú etidium-bromid-oldattal festjük, és a 789 bázispárból álló fragmensnek megfelelő csíkot kivágjuk. A csíkról a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel eluáljuk. Az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el a dezoxi-ribonukleinsavról, majd etanolos kicsapással izoláljuk a molekulákat. 1,1 pg tisztított, 7,89 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst ezután 12 egység Mspl restrikciós enzimmel emésztünk 75 pl Hpal-pufferban. A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük, 1 órán át. Fenolos extrakciót követően a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el, és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ezután 2000 egység Sl-nukleázzal kezeljük a dezoxiribonukleinsav-fragmenseket, a reakciót ! 50 pl Sl-pufferban végezzük, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakció leállítására 15 pl, 500 mmólos trisz-hidrogén-klorid (pH=8,0) és 15 pl, 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot adagolunk, majd fenolos extrakciót végzünk. A fenol és a cinkionok eltávolítására éterrel extraháljuk az elegyet, és 0,01 XSSC oldattal szemben 4°C hőmérsékleten kétszer 1,5 órán át dializáljuk, majd etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. 10 pg pYM053 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat közben 12 egység Hpal restrikciós enzimmel emésztünk 100 pl Hpal-pufferban. A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. 0,7% agaróz gélen elektroforézissel tisztítunk egy 8 kb nagyságú fragmenst, és az 1,1 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ribonukleinsavat ezután 0,12 egység BAP-val kezelünk, 75 pl BAP-pufferban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten, a Hpal tompa végek egymáshoz kapcsolásának gátlására. A BAP teljes eltávolítására háromszor fenollal extraháljuk az elegyet, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással izoláljuk, majd ezután csökkentett nyomású térben szárítjuk. A pYM053 plazmidból származó, 8 kb nagyságú Hpal fragmens 0,4 pg-ját 0,05 pg, a pYM053 plazmidból származó és Mspl enzimmel emésztett 789 bázispárból álló fragmens-készítménnyel keverjük. A dezoxi-ribonukleinsav-molekulákat 400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal kapcsoljuk (az enzimet az alábbi helyről vásároltuk: New Elngland Biolabs.). A reakciót 0,8 mmól/1 adenozinn-trifoszfátot tartalmazó, 15 pl térfogatú ligáz-pufferban végezzük, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 10 pl ligációs elegygyel E. coli W620 recA (NRRL B-15024) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint és 40 pg/ml X-gal-t tartalmazó L-táptalaj felületére juttatjuk. A 54 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 l
