197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 A pKEN007 plazmid C-beépítési helyének leolvasási sémáját ezután C-2 és C-3 leolvasási sémákat tartalmazó plazmidok előállítására módosítjuk, oly módon, ahogy az előzőekben megadtuk az A-l leolvasási fázis A-2 vagy A-3 leolvasási fázissá alakítása során. Ezt a folyamatot sematikusan ábrázoljuk a 23. ábra 148 és 149 helyén. Az EcoRI hasítási hely körüli dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia megfelelő módosításait a 24. és 25. ábrán adjuk meg. Érthető, hogy hasonló módszert használhatunk a pK.EN030 (A-l) plazmidból kiinduló pKEN024 (A-2) és a pKEN036 (A-3) plazmidok előállítására, mint amit a fentiekben a 13. és 14. ábrák kapcsán megadtunk a pKEN007 (C-l) plazmidból kiinduló pKEN046 (C-2) és pKEN019 (C-3) előállításakor. 3) A pKEN042, pKEN043 és pKEN044 plazmidok előállítása A C-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállításának utolsó lépéseként a PKEN007, pKEN046 és pKEN019 C-helyet tartalmazó fragmensek három különböző Xbal-EcoRl szakaszait helyettesítjük a pKEN037 plazmid A-helyet tartalmazó Xbal-EcoRI fragmensével. Ezt a 26. ábrán adjuk meg. A helyettesítést úgy végezzük, hogy a C-helyet tartalmazó plazmidok ugyanazt az EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzimek által felismert szekvenciákat tartalmazzák a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítésére szolgáló helyen, mint amit az A- és B-hellyel rendelkező plazmidok. Ahogy azt a 26. ábra 150 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk, a pKEN007, pKEN046 és pKEN019 plazmidokból származó három C-helyet tartalmazó fragmens olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát hordoz, amely tartalmazza az E. coli lpp gén Sau3A fragmenséből kapott szignál pepiid részt. Ügy járunk el, ahogy a 15. ábra kapcsán leírtuk a pKEN037 nagyobb Xbal-EcoRI fragmensének előállítása kapcsán. 1 pl vizes pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens-keveréket kombinálunk az előzőleg a pKEN007, pKEN046 és pKEN019 plazmidokból előállított, 0,1—0,1 pg-nyi különböző Xbal-EcoRI kisebb fragmensekkel. Ezeket Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel történő kezeléssel és az ezt követő gél-elektroforézises tisztítással kapjuk. Mindegyik dezoxi-ribonukleinsav-keveréket 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten 16 órán át. 10—10 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) sejteket transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsok között olyan plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat hordozó sejteket találunk, amelyek C-l, C-2 és C-3 leolvasási sémát hordoznak. A plazmidokat tisztítjuk és pKEN042, pKEN043 és pKEN044 jellel jelöljük. Szerkezetüket a 26. ábra 151 helyén adjuk meg. 45 24 D) Az indukálható kifejeződő pIN-II plazmidok előállítása A 27. ábrán sematikusan ábrázoljuk azt az eljárást, amelynek során előállítjuk az A-beépítési helyet A-l leolvasási fázisban hordozó indukálható plazmid klónozó hordozók (a pKEN037 konstitutív plazmidoknak felel meg) előállítását. Az lac UV5 promoter-operátor a pOP203-3 plazmidból ered (Fullertől kaptuk, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University). A lac UV5 promoter-operátor rendszert az E. coli 4288 recA/pKM006 (NRRL B-15017) törzsből nyerhetjük, a törzset letétbe helyeztük a Northern Regional Research La - boratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, állandó törzsgyűjteményében. A lac UV5 promoter-operátor rendszert a pKEN006 plazmid 95 bázispárból álló Xbal fragmense tartalmazza. A plazmidot az NRLL B-15017 sorszámú törzsből ismert módon izoláljuk, és a 95 bázispárból álló Xbal fragmenst ezután szintén ismert technikákkal különítjük el. A lac UV5 promoter-operátor rendszert a pKEN037 plazmid Xbal hasítási helyébe építjük be (az lpp gén 5’-nem transzlatált szakaszán belül). Ügy járunk el, hogy 200 pg pOP203-3 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység Alul restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 400 pl HindlII-pufferban, és a 95 bázispárból álló Alul, az lac UV5 promotert és operátort hordozó fragmenst (a 27. ábra 152. helyén diagonális vonalkázott résszel jelöljük) poliakril-amid gél-elektroforézissel tisztítjuk. 1 pg, 95 bázispárból álló Alul fragmenst 400 pikomól foszforilezett Xbal linkerrel (5’-CTCTAGAG-3’; a Collaborative Pesearch terméke, foszforilezését az előzőekben megadottak szerint végezzük) keverünk, és 5 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal tompa-végligációt végzünk 20 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligáit elegyet BamHI-pufferral 300 pl térfogatra hígítjuk, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 100 egység Xbal restrikciós enzimmel kezeljük a keveréket 1 órán át 37°C hőmérsékleten, amiután Xbal kohézív végeket kapunk. Az elegyet fenollal extraháljuk, majd ezt követően etanollal kicsapjuk és fagyasztva szárítjuk. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 pl vízben oldjuk, és 0,3 pg így előállított lac fragmenst 0,5 pg pKEN037 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, ez utóbbit előzőleg Xbal restrikciós enzimmel hasítjuk. Az elegyet 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át, amikor az Xbal kohézív végek összekapcsolódnak és a plazmid újra körré zárul. 10 pl ligációs eleggyel E. coli JA221/F’-lacl’ (NRRL B-15015) sejteket transzfor46 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
