197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 48 málunk, a törzset úgy állítottuk elő, hogy a X90/F’lacl<' lac+pro+tőrzs (Beckwith-től kaptuk, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Harvard University) F’-faktorát bejuttattuk az E. coli JA221 törzsbe 5 (NRRL B-15014). Az E. coli JA221/F’lacF törzs a Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, állandó törzsgyűjteményében található meg. Az ampicillin-rezisz- 10 tens transzformánsokból izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavak (gyors alkalikus-denaturációs módszer) restrikciós enzim-analízise szerint egyikük egy másolat 95 bázispárból álló, a pKEN037 Xbal helyére megfelelő őrien- 15 tációban beépült Alul fragmenst tartalmaz, ahogy azt a 27. ábra 153 jellel jelölt helyén látjuk. A plazmidot pKEN038 jellel jelöljük. A B- és C-beépítési helyeket tartalmazó, indukálható plazmidok előállításának egy- 20 szerűsítésére először eltávolítjuk a pKEN038 lac promoter-operátor fragmensét körülvevő Xbal hasítási helyek (kettő) egyikét. A lac promoter-operátor fragmenstöl balra eső Xbal hasítási hely eltávolítását a 27. ábra 154. jel- 25 lel jelölt helyén mutatjuk be. Ügy járunk el, hogy kihasználjuk azt a tényt, hogy az Xbal linker kötődése a 95 bázispárból álló lac promoter-operátor fragmenshez egy új SstI hasítási helyet hozott létre a lac promo- 30 ter balra eső végénél, de nem jött létre ilyen hely a jobbra eső végen. Ahogy azt a 27. ábra 155. jellel jelölt részén látjuk, az SstI restrikciós enzim által felismerhető szekvencia átfedi az Xbal enzim szekvenciáját. így az 35 SstI hasítási hely 4 bázisból álló ragadós végének SÍ nukleázzal való eltávolítása az Xbal felismerési hely egy részét is eltávolítja, ezzel megszűnik az Xbal hasítási szakasz. Ügy járunk el, hogy 5 pg pKEN038 plaz- 40 mid dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység SstI restrikciós endonukleázzal emésztünk 50 pl BamHI-pufferban, és ezután 500 egység SÍ nukleázzal kezeljük 200 pl SÍ pufferban, 20°C-on, 1 órán át. Az SÍ-kezelt dezoxi-ribo- 45 nukleinsav 0,5 pg-nyi mennyiségét 5 egység T4 dezoxi-ribönukleinsav-ligázzal kezeljük, 10 pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, a tompa végek kapcsolására. A reakciót 16 órán át végezzük, 50 12,5°C hőmérsékleten. 5 pl ligációs eleggyeí E. coli JA221 /F’laclv törzset (NRRL B-15015) 47 transzformálunk. A 27. ábra 156. helyén sematikusan ábrázolt szerkezetű plazmidot izoláljuk az ampicillin-rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izolált egyik plazmidból. Az ábrán a restrikciós enzimmel végzett analízis eredményeit mutatjuk be. A plazmidot pKEN045 jellel jelöljük (pIN-II A-I). Több módszer áll rendelkezésünkre az A-2 és A-3 leolvasási sémával rendelkező pIN-II plazmidok előállítására. Az A-2 és A-3 pIN-I típusú, rendelkezésre álló plazmidokat íigyelembevéve, az egyik módszer szerint a pKEN039 és pKEN040 plazmidokba beépítjük a lac promoter-operátor fragmenst, mégpedig a 27. ábra és az előzőekben a pKEN037 plazmid kapcsán megadottak szerint eljárva. Eljárhatunk úgy is, hogy ez az előnyős módszer, hogy a pKEN039 és pKEN040 Xbal-EcoRI kisebb fragmensét beépítjük a pKEN045 Xbal-EcoRI helyére, mégpedig a 15. ábra kapcsán elmondottak szerint eljárva, így megkapjuk a pKEN049 (pIN-II, A-2) és pKEN050 (pIN-II, A-3) plazmidokat. Másrészről, mivel a megfelelő konstitutív plazmidokat még nem állítottuk elő, az indukálható pKEN049 (A-2) és pKEN050 (A-3) indukálható plazmidokat közvetlenül előállíthatjuk a KEN045 (A-l) plazmidból. A pKEN045 plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxí-ribonukleinsav-szekvencia maga is módosítható a 13. ábra b. és c. sémája szerint, vagy a 14. ábra b. és c. részén megadottak szerint eljárva, amikor közvetlenül megkapjuk a pKEN049 (A-2) vagy pKEN050 (A-3) plazmidokat. Ez ezen plazmidok előállításának legelőnyösebb módja, mivel nem szükséges a megfelelő konstitutív plazmidokat előállítanunk. A B- és C-beépítési helyeket magába foglaló pIN-II plazmidok előállítására is többféleképpen járhatunk el. Mivel a megfelelő pIN-I plazmidokat már előállítottuk, mindegyik módosítható a lac promoter-operátor-íragmens beépítésével, amit egyébként a 27. ábrán megadottak szerint végzünk, vagy előnyösen a pKEN045 (pIN-II, A-l) kisebb Xbal-EcoRI fragmensét helyettesítjük a konstitutív B-helyet tartalmazó és C-helyet tartalmazó plazmidok kisebb Xbal-EcoRI fragmensével, amiután az I. táblázatban megadott pIN-II plazmidokhoz jutunk. I, Tábla Kát Beépítési hely Leolvasási séma fTÍI-1 plazmidoJí plN-11 plazmidok B i pKl£»OA1 pKBN051 2 pKFHOh? pKEW052 3 pKFNOAB pKEN053 C 1 pKTN042 PKEN05A 2 pKl:U0A3 pKEH055 3 pKKHO-Vv pKELuSG 25
