197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 A 22—26. ábrákon sematikusan szemléltetjük a C beépítési hellyel rendelkező rekombináns plazmidok előállításának módját, az ábrákat az alábbi, részletes leírással kell összevetnünk. 1) A pKEN006 plazmid előállítása A C hellyel rendelkező klónozó hordozók előállítására a pKEN005 plazmidba a 22. ábra 145 helyen jelölt része szerint eljárva klónozzuk a 193 bázispárból álló, az lpp promoted tartalmazó Sau3A fragmenst és az 5’-nem transzlatált régiót, továbbá az E. coli lpp gén szignál peptid szakaszát és az első 8 Struktur kodont (ezt a fragmenst az 5. ábra 105C helyén ábrázoljuk). Ügy járunk el, hogy 200 pg pKENI 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, amit ismert módon az E. coli CC620/pKENlll (NRRL B-15011) törzsből állítunk elő, teljesen emésztünk 200 egység Sau3A restrikciós endonukleázzal, 400 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: lOmmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 10 mmól magnézium-klorid, 60 mmól nátrium-klorid literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin. A reakciót 1 órán át végezzük, 37°C hőmérsékleten. Az emésztés teljessé-válását követően fenolos extrakciót végzünk, a dezoxi-ribonukleinsavat etanolos kicsapással különítjük el, és a 193 bázispárból álló Sau3A fragmenst akrilamid gél-elektroforézissel tisztítjuk. Mivel az Sau3A restrikciós enzimmel való kezeléskor ragadós végek keletkeznek mindkét végen, ezeket a végeket tompa végű molekulák előállítására T4 dezoxiribonukleinsav-polimerázzal feltöltjük. A 2 pg tisztított, 193 bázispárból álló Sau3A fragmenst 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezelünk, 20 pl polimeráz-pufferban, amelyhez 0,1—0,1 mmól/1 dATP, dGTP, dCTP és dTTP vegyületet adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 45 percen át. Fenollal extraháljuk az elegyet és etanollal kicsapjuk, a kapott dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekét 400 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverjük és 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsolunk 20 pl, 0,6 mmól/ /I adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 300 pl-re hígítjuk az elegyet EcoRI-pufferral, és 150 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk EcoRI kohézív végek előállítására. 1 pg EcoRI enzimmel emésztett fragmenst 0,5 pg EcoRI enzimmel emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval keverünk, és a keverékhez 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk 40 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) sejteket transzformálunk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denatu-43 rációs módszerrel izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzimmel végzett analízise szerint a plazmidok egyike a 193 bázispárból álló Sau3A fragmensből származó EcoRI fragmenst hordoz. Ezt a plazmidot a 22. ábra 146 helyén mutatjuk be, és PKEN006 jellel jelöljük. A pKEN006 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának nukleotid-szekvencia-analízise szerint a pKEN006 EcoRI a C beépítési helynél helyezkedik el, és megfelel a C-l leolvasási sablonnak. 2) A pKEN007, pKEN019 és pKEN046 plazmidok előállítása A C-2 és a C-3 leolvasási mintának megfelelő C-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállítására először eliminálnunk kell a pKEN006 két EcoRI hasítási helye közül az egyiket. A 23. ábrán sematikusan ábrázoljuk az lpp promotertől balra eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját. Az eljárás során a pKENOOö plazmidból egy 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst, (ez a fragmens tartalmazza a szignál peptidet, az 5’-nem transzlatált régió egy részét és az E. coli lpp gén strukturgén-szekvenciájának egy szakaszát) átjuttatjuk a pKENOlO plazmid Xbal-EcoRI helyére. Ügy járunk el, hogy 5 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat először 5 egység Xbal restrikciós endonukleázzal kezelünk, 50 pl BamHI-pufferban, majd az emésztést 5 egység EcoRI restrikciós enzimmel 100 pl EcoRI-pufferban megismételjük. A linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 5 pl BAP-vel kezeljük 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0 és 0,1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav, literenként A reakciót 30 percen át végezzük 37°C hőmérsékleten. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk, majd 0,5 pg dezoxi-ribonukleinsavat 0,2 pg, 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenssel keverünk, amely utóbbit előzőleg állítottunk elő a pKEN006 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 50 pg-jából EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel történő kezeléssel, majd az ezt követő poliakril-amid gél-elektroforézissel. A dezoxi-ribonukleinsav keveréket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk 40 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 7 órán át. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzim analízise szerint egy plazmid tartalmazza C-l leolvasási sémában az E. coli lpp gén szignál peptid szakaszát hordozó, 106 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst. Ezt a 23. ábra 147. helyén mutatjuk be, a plazmidot PKEN007 jellel jelöljük. 44 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
