197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 és 20. ábra b. részén mutatjuk be. Jelenleg nem érthető miért, de úgy találtuk, hogy a +90 pozícióba három extra bázispár épült be, (így egy extra aminosav bioszintézise van itt meghatározva), továbbá egy extra G-C bázispár található a +99 pozícióban. Ezen változások meglepő kumulatív hatásaként az S. marcescens lpp gén szignál peptidjének hasítási helyét meghatározó szakasz aminosav-szekvenciája átalakult az E. coli lpp génnek megfelelő szakasszá. 3) A pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidok előállítása A B-2 és a B-3 leolvasási mintának megfelelő B-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállítására először elimináljuk a két EcoRI hasítási helyet a pKEN009 plazmidból. A 18. ábrán sematikusan ábrázoljuk az lpp promotertől balra eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját. Az eljárás során egy 80 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenst (ez tartalmazza az S. marcescens lpp gén szignál peptidjét és az 5’-nem transzlatált szakasz egy részét) átépítjük a pKEN009-ből a pKENOlO Xbal-EcoRI helyére. Ügy járunk el, hogy 5 pg pKENOlO plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység BxaI restrikciós endonukleázzal emésztünk 50 pl BamHI-pufferban, majd ezt követően 100 pl EcoRI-pufferban 5 egység EcoRI restrikciós enzimmel hasítunk. A linearizált dezoxi-ribonukleinsavat ezután 5 pl BAP-vel kezeljük, 100 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH+8,0, és 0,1 mmól etilén-diamin-tetraecetsaV literenként. A reakciót 30 percen át 37°C hőmérsékleten végezzük. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk, majd 0,5 pg dezoxi-ribonukleinsavat 0,2 pg, 80 bázispárból álló Xbal-EcoRI fragmenssel keverünk, ez utóbbit úgy kapjuk, hogy 50 pg pKEN009 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel kezelünk, és poliakril-amid gél-elektroforézist végzünk. A dezoxi-ribonukleinsav-keveréket ezután 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 40 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokból a gyors alkalikus-denaturációs módszerrel kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavak restrikciós enzim-analízise szerint az egyik plazmid hordozza a kívánt 80 bázispárból álló, és az S. marcescens lpp gén szignál pepiid szakaszát B-l leolvasási fázisban hordozó Xbal-EcoRI fragmenst, ahogy azt a 18. ábra 140 jellel jelölt részén látjuk. Ezt a plazmidot pKEN017 jellel jelöljük. A pKEN017 plazmidban lévő B-beépítési hely leolvasási fázisát ezután módosítjuk 41 22 olyan plazmidok előállítására, amelyekben B-2 és B-3 a leolvasás módja, mégpedig az előzőekben az A-l leolvasás A-2 vagy A-3 leolvasássá alakítás módszere szerint eljárva. Ezt a módszert sematikusan a 18. ábra 141 és 142 helyén ábrázoljuk. Az EcoRI hasítási hely körül elhelyezkedő dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia megfelelő módosításait a 19. és 20. ábrákon mutatjuk be. Érthető, hogy hasonló módszereket használunk a pKEN024 (A-2) és a pKEN036 (A-3) előállítására a pKEN030 (A-l) plazmidból kiindulva. A 13. és 14. ábrákon megadottak szerint eljárva állítjuk elő a pKEN017 (B-l) plazmidból a pKEN026 (B-3) és a pKEN027 (B-3) plazmidokat. 4) A pKEN041, a pKEN047 és a pKEN048 plazmidok előállítása A 21. ábrán sematikusan szemléltetjük a B-helyet hordozó klónozó molekulák előállításának utolsó lépését, amelynek során a pKEN037 Xbal-EcoRI A-helyet hordozó fragmensét kicseréljük a pKEN017, pKEN026 és a pKEN027 plazmidok három különböző, Xbal-EcoRI B-helyet hordozó fragmenseivel. Erre azért van szükség, hogy a B-helyet tartalmazó plazmidokba a külső dezoxi-ribonukleinsav beépítésére alkalmas helyen hasonló EcoRI, HindlII és BamHI restrikciós enzim felismerő szekvenciákat biztosítsunk,-mint az A-helyet hordozó plazmidokban. Ahogy azt a 21. ábra 143 jellel jelölt részén sematikusan szemléltetjük, a pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidokból származó három B-helyet tartalmazó fragmens mindegyike tartalmazza az S. marcescens lpp gén Fnu4H-I fragmenséből származó szignál pepiidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát. Ügy járunk el, mint ahogy a 15. ábra kapcsán megadtuk, a pKEN037 plazmid nagyobb Xbal-EcoRI fragmensének előállítását. 1 pl pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens-keveréket egyesítünk a pKEN017, a pKEN026 és a pKEN027 plazmidokból előállított 0,1 pg mennyiségű, különböző Xbal- EcoRI kis fragmenssel. A kis fragmenseket Xbal és EcoRI restrikciós enzimekkel való kettős emésztéssel és az ezt követő géltisztítással állítjuk elő. A dezoxi-ribonukleinsav-keveréket 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligációs elegyek mindegyikének 10 pl-ével E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens transzformánsok között a B-l, B-2 és B-3 leolvasási fázisban lévő plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat tisztítjuk, és ezeket sorrendben PKEN041, pKEN047 és pKEN048 jellel jelöljük, szerkezetüket a 21. 'ábra 144 helyén adjuk meg. C) A C-hellyel rendelkező plazmidok (pIN-I) előállítása 42 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
