197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
Közben egy 8,5 kb nagyságú, az S. marcescens Ipp gént hordozó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst izolálunk (lásd a 16. ábra 136 helyét) egy lambda hibrid tágból, amely hordozza az S. marcescens lpp gént. (lambda IppSm-l.) Az lpp gént előzőleg egy lambda tág vektorba a Charon 14-be klónozták [Blattner és munkatársai, Science, 196, 161 — 169 (1977)]. Az alábbiak szerint járunk el: Az S. marcescens-ből izolált össz-DNS 200 pg-ját 200 egység EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket preparatív agaróz gélen különítjük el, és az 5’-32P-lipoprotein mRNS molekulával pozitív hibridizációt mutató, 8,5 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. A hibridizációt Southern-hibridizációs módszerrel végezzük. A 8,5 kb nagyságú EcoRI fragmenseket (körülbelül 20-szorosra sűrítve) és az EcoRI enzimmel hasított Charon 14 vektor dezoxi-ribonukleinsavat T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K802 (NRRL B-15016) törzset fertőzünk. Az lpp gént hordozó rekombináns fágokat plakk-hibridizációs technikával választjuk ki [Benton és Davis módszerével, 5’-P32-lipoprotein mRNS-t használva] . Egy pozitív hibridizációt adó plakk-ot lambda lppSm-1 jellel jelölünk. Két pg lambda lppSm-1 dezoxi-ribonukleinsavat ezután BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel teljesen kezelünk a fentiekben a pBR322 linearizálásakor megadottak szerint eljárva. 0,5 pg lambda IppSm-l dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst 0,5 pg előzőleg linearizált pBR322 dezoxi-ribonukleinsavval keverünk 40 pl ligáz-pufferban. Az elegyet 5 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, és az EcoRI és BamHI kohézív végeket 16 órán át 4°C hőmérsékleten, és 1 órán át 0°C hőmérsékleten át tartó kezeléssel kapcsoljuk. 0,4 mmól végkoncentrációban adenozin-trifoszfátot és 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adagolunk, majd az elegyet 7 órán át 12,5°C hőmérsékleten inkubáljuk. A ligációs elegy negyed részévei ezután E. coli lpp deléciós mutáns JE5527 jelű (NRRL B-15012) törzset transzformálunk. A transzformációt Cohen és munkatársai szerint végezzük [Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69, 2110—2114 (1972)]. Az ampicillin-rezisztens transzformánsokat egy éjszakán át Whatman 3MM szűrőpapíron növesztjük, L-táptalajt tartalmazó agar felületére helyezzük a szűrőpapírokat, az agarba ml-enként 50 pg ampicii lint adunk. Telep-hibridizációval vizsgáljuk az lpp kiónokat. Lpp gént tartalmazó, a lambda lppEc-1 -bői származó, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmens nick-transzlatálódott az [a-P32] dATP és az [a-P32] dCTP molekulákhoz, a kísérletet Maniatis és munkatársai szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sei., USA. 72, 1184—1188 (1975)]. Ezt használtuk P32- -próbaként. Egy pozitív hibridizációt mutató transzformáns tartalmazta a 16. ábra 137 39 helyén jelzett szerkezetű plazmidot, ezt PKEN221 jellel jelöljük. 2) A pKEN009 plazmid előállítása A B-helyet tartalmazó klónozó hordozók előállítására az lpp promotert és az 5’-nem transzlatált szakaszt, továbbá az S. marcescens lpp gént (ezt a fragmenst sematikusan az 5. ábra 105B helyén mutatjuk bé) tartalmazó, 329 bázispárból álló Feu4H-I fragmensét először a 17. ábra 138 helyén megadottak szerint eljárva, a pKEN005 plazmidba klónozzuk, az alábbiak szerint: 80 pg pKEN221 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 egység Fnu4H-I restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs.) teljesen emésztünk, 400 pg HaelII pufferban, majd a kapott 324 bázispárból álló Fnu4H-I fragmenst akrilamid gél-elektroforézissel tisztítjuk. Mivel a Fnu4H-I restrikciós enzimmel végzett emésztés után mindkét végen ragadós végű fragmensek keletkeznek, ezeket a végeket T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal tompa végekké töltjük fel. 2 pg tisztított, 324 bázispárból álló Fnu4H-I fragmenst 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezelünk, 20 pl polimeráz-pufferban, 0,1 — 0,1 mmól dATP, dGTP, dCTP és dTTP jelenlétében, 12,5°C hőmérsékleten, 45 percen át. Fenollal extraháljuk az elegyet, és etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, majd ezeket 400 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverjük, és 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal egészítjük ki a 20 pl térfogatú ligáz-pufferral készült reakcióelegyet, amelyhez 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot is adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. 300 pl-re egészítjük ki az elegy térfogatát EcoRI-pufferral, és EcoRI kohézív végek előállítására 150 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk. 1 pg EcoRI enzimmel emésztett fragmenst keverünk 0,5 pg EcoRI-emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavval, és az elegyhez 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk, 40 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük, 16 órán át. 20 pl ligációs eleggyel E. coli JE5519 (NRRL B-, -15013) törzset transzformálunk. A tetracikünre rezisztens transzformánsokból gyors alkalikus-denaturációs módszerrel izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és restrikciós enzimmel analízist végzünk. Az egyik plazmid hordoz egy 334 bázispárból álló, a 329 bázispárból álló Fnu4H-I fragmensből' származó EcoRI fragmenst. Ezt a plazmidot pKEN009 jellel jelöljük, és a 17. ábra 139 helyén mutatjuk be. A pKEN009 plazmid dezoxi-ribonukleinsavának nukleotid-szekvencia-analíziséből kiderül, hogy a pKEN009 EcoRI helye a B-beépítési helyhez kerül, és megfelel a B-l leolvasási fázisnak. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját a 19. 40 21 197937 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
