197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 Az EcoRI hasítási hely visszaállítására 1 pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat először 240 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és tompa-végligációt végzünk 4 egység T4-dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 15 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszíátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. Az elegyet ezután 250 pl-re hígítjuk EcoRI-puffer adagolásával, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 100 egység EcoRI restrikciós endonukleázt adagolunk és 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, a fölösleges linker molekulák eltávolítására, és EcoRI kohézív végek előállítására. Fenollal extraháljuk a reakcióelegyet és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. 0,3 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 15 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Egy éjszakán át 100 ml, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-táptalajban tenyésztünk három, ampicillinre rezisztens transzformánst, és izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. Meghatározzuk az EcoRI hasítási helyek dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját. Ezek egyikének bázis-sorrendjét a 14. ábra c. részén mutatjuk be, a plazmidot pKEN036 (A - 3) jellel jelöljük. A pKEN037 (A-l) transzlációs leolvasási fázisát a másik két leolvasási fázissá A-2 és A-3 változtatására a pKEN037 kisebb Xbal-EcoRI fragmensét a kisebb, a pKEN024 (A-2) vagy a pKEN036 (A-3) Xbal-EcoRI fragmensével cseréljük ki, ahogy azt a 15. ábrán bemutatjuk. Úgy járunk el, hogy 3 pg pKEN037 plazmidot először (ahogy azt a 15. ábra 131 helyén bemutatjuk) 6 egység Xbal restrikciós enzimmel kezeljük, 50 pl BamHI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. Az Xbal enzim inaktiválását követően a linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 6 egység EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, 100 pl EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakció során. Agaróz gél-elektroforézissel izoláljuk a nagyobb Xbal-EcoRI fragmenst a kisebbtől. Az agaróz gélen lévő dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 1 pg/ml etidium-bromiddal festjük, és a nagy fragmensnek megfelelő csíkot kihasítjuk. Fagyasztást követően eluáljuk ezt a csíkot a gélről. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekről az etidium-bromidot fenolos extrakcióval távolítjuk el, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással izoláljuk. A szárított dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 20 pl vízben oldjuk, és 1 pl alikvot pKEN037 dezoxi-ribonukleinsav-fragmens-keveréket egyesítünk 0,1—0,1 pg kisméretű, a pKE.N024 vagy a pKEN036 plazmidokból származó Xbal-EcoRI restrikciós fragmensekkel (lásd a 15. ábra 132 helyét). Eze37 20 két a fragmenseket az adott plazmidból Xbal és EcoRI kettős restrikciós enzimes kezeléssel, majd géltisztítással állítjuk elő, ahogy azt a 15. ábra 133 jellel jelölt helyén látjuk. Az Xbal-EcoRI fragmensek ragadós végeit 0,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsavligázzal kapcsoljuk. Á reakciót 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban végezzük, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Az ampicillinre rezisztens transzformánsok között olyan telepeket találunk, amelyek plazmid dezoxi-ribonukleinsava A-2 és A-3 leolvasási fázissal rendelkezik, ezeket, sorrendben pKEN039 és pKEN040 jellel jelöljük. Szerkezetüket a 15. ábra 134 helyén mutatjuk be. Az előzőekben ismertetett kísérleteket a pKEN039 (A-2) és a pKEN040 (A-3) első esetben való előállítására végeztük. A szakemberek számára azonban érthető, hogy ezen plazmidok előállítására más módszereket is használhatunk. így például a pKEN037 (A-l) plazmid EcoRI hasítási helyének szomszédságában lévő dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát magát is módosíthatjuk a 13. ábra b. és c. vagy a 14. ábra b. és c. helyén megadottak szerint eljárva, amiután megkapjuk a pKEN039 (A-2) vagy a pKEN040 (A-3) plazmidokat. B) A B-típusú plazmidok (plN-1) előállítása A 16—21. ábrákon sematikusan szemléltetjük azoknak a rekombináns plazmidoknak az előállítását, amelyek a B-beépítési helyet tartalmazzák. Az ábrákat az alábbiakkal öszszevetve kell vizsgálni. 1) A pKEN221 plazmid előállítása A B-helyet tartalmazó kifejeződő plazmidok előállításának első lépéseként egy olyan plazmidot állítunk elő, amely tartalmazza az Ipp gén fragmenseket, mégpedig úgy, hogy az rendelkezzen egy restrikciós hasítási helylyel a szignál pepiid hasítási helyén, vagy annak közelében. A kiválasztott gén a Serratia marcescens lipoproteint határozza meg, és a szignál peptid 3’-végén egy Fnu4H-l restrikciós endonukleáz által felismerhető he'yet hordoz. Az S. marcescens lpp gént felvevő plazmidként a pBR322 plazmidot választottuk. Ahogy azt 4 16. ábra 135 jellel jelölt részén látjuk, 2 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység BamHI restrikciós endonukleá^zal teljesen emésztünk 50 pl BamHI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át. A BamHI enzim inaktiválására a reakcióelegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd 2 egység EcoRI-t és 100 pl EcoRI-puffert adagolunk. 60 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a reakció leállítására fenolos extrakciót végzünk. A linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket etanolos kicsapással izoláljuk. 38 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
