197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
* végezzük, 20 |xl 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk, az ampicillin-rezisztens telepekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, ezek közül az egyiknek a szerkezetét all. ábra 130 jellel jelölt részén adjuk meg. A plazmidot pKEN037 jellel jelöljük. A pKEN037 plazmid dezoxi-ribonukleinsav nukleotid-szekvenciájának analízisekor kiderült, hogy a 12. ábrán megadott dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia az érvényes (e. rész), kiderül az is, hogy egy G-C-pár kiesett a Hind III és BamHI hasítási helyek között (ennek oka jelenleg nem ismert), és bizonyítottnak tekinthetjük, hogy a pKEN037 a konstitutív A-l klónozó hordozóval azonos. 7) A pKEN039 és a pKEN040 plazmidok előállítása A pKEN037 plazmidba beépített dezoxi-ribonukleinsav-fragmensek leolvasási fázisától különböző termékek előállítására az A-2 és az A-3 lpp gén klónozó hordozókat állítjuk elő, oly módon, hogy a pKEN030 leolvasási fázisát az EcoRI hasítási helyre helyezzük át. A 13. és 14. ábra a. részén szemléltetjük a pKENl 11-ben lévő prolipoprotein transzlációs iniciációs helyét környező dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat. Ahogy az látszik is, ez a szekvencia a +45 és +46 pozíciókban egy Alul hasítási helyet tartalmaz. A pKEN008 plazmid előállítására egy EcoRI linkért kötünk az Alul véghez, amiután megkapjuk a 13. és 14. ábrák b. részén szemléltetett dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát a pKEN008, a pKENOlO, és a pKEN021, illetve pKEN030 plazmidokban. A +47 és +48 pozíciók között egy EcoRI hasítási helyet állítunk elő. A pKEN030 dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját az EcoRI helynél módosítjuk, ahogy azt a 13. és 14. ábra c. részén jelöljük, aminek eredményeképpen a leolvasási fázist egy, illetve két bázissal módosítjuk. Ügy járunk el, hogy az A-2 leolvasási fázisú plazmid előállítására 5 pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 100 pl EcoRI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át tartó reakció során. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavakat 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polimerázzal kezeljük, 30 pl polimeráz-pufferban, 0,1 mmól/1 dGTP és 0,1 mmól/1 dATP jelenlétében, 12,5°C hőmérsékleten, 45 percen át. A reakció leállítására 25 mmól végkoncentrációban etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk, majd fenollal extrahálunk. Az eljárás során a négy bázisból álló EcoRI ragadós vég fele két adeninnel feltöltődik. A megmaradó két egyszálú adenincsoportot SÍ nukleázzal eltávolítjuk, 200 pl SÍ-pufferban, 20°C-on 1 órán át végzett reakcióval. A reakció leállítására 20 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 20 pl, 35 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk. Az elegyet fenollal extraháljuk, és egy éjszakán át 0,01 X SSC-vel szemben dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk és 100 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban szuszpendáljuk. Az oldott dezoxi-ribonukleinsavakat 250 pl etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. Az EcoRI hasítási hely visszaállítására I pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat először 70 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és 3,2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal tompa-végligációt végzünk II pl, 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban 16 órán át 12,5°C hőmérsékleten. Az elegyet 50 pl-re hígítjuk EcoRI-pufferral, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 20 egység EcoRI restrikciós endonukleázt adagolunk, és az elegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a felesleges linker molekulák eltávolítására, és EcoRI kohézív végek előállítására. Ezután fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanollal kicsapjuk. 0,5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal . kezeljük, 15 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk. Három ampicillin-rezisztens transz+rmánsból izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, az izolálás előtt a sejteket egy éjszakán át 10 ml L-táptalajban tenyésztjük, amelyhez ml-enként 50 pg ampicillint adunk. A dezoxi-ribonukleinsav EcoRI hasítási helyének dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját megállapítjuk. Az egyiknek a szekvenciáját a 13. ábra c. részén mutatjuk be, ezt pKEN024 sorszámmal jelöljük (A-2). Az A-3 leolvasási fázisban lévő plazmid előállítására 5pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat teljesen emésztünk EcoRI restrikciós enzimmel, 100 pl EcoRI pufferral készült reakcióelegyben, 37°C hőmérsékleten, 60 percen át. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően az EcoRI ragadós végeket eltávolítjuk oly módon, hogy 4,4 pg dezoxi-ribonukleinsavat 500 egység Sl-nukleázzal kezelünk, 150 pl Sl-pufferban, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakciót 15 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-klorid (pH= =8,0) és 15 pl, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav adagolásával állítjuk le. Fenollal exíraháljuk az elegyet, és 4 órán át 0,01 X SSC-vel szemben (lásd előbb) dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, és 100 pl, 0,3 mólos nátrium-acetátban újra szuszpendáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 250 pl etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk, és csökkentett nyomású térben szárítjuk. 36 197937 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
