197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a Clal kohézív végeket 600 egység SÍ nukleázos kezeléssel eltávolítjuk. A reakciót 200 pl Sl-pufferban végezzük, 1 órán át 20°C hőmérsékleten. A reakció leállítására 20 pl, 0,5 mólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 20 ni, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk. Ezután fenollal extraháljuk az elegyet és 4 órán át 0,01 X SCC-vel szemben dializáljuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk, centrifugáljuk, és lOOpl, 0,3 mólos nátrium-acetátban oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 250 pl etanollal újra kicsapjuk, centrifugáljuk és csökkentett nyomású térben szárítjuk. 1 pg SÍ-kezelt dezoxi-ribonukleinsavat 70 pikomól foszforilezett HindlII linkerrel (5’-CCAAGCTTGG-3’; a Collaborative Research terméke, az előzőekben megadottak szerint foszforileztük), és tompa-végligációt végzünk 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 20 pl, 0.6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. 100 pl HindlII pufferral hígítjuk az elegyet, és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 20 pl HindlII restrikciós endonukleázt adagolunk, és az elegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a feles linker molekulák eltávolítására és HindlII kohézív végek előállítására. Ezután fenollal extraháljuk a reakcióelegyet, a dezoxi-ribonukleinsavakat pedig etanollal kicsapjuk. 0,5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat újra körré zárunk oly módon, hogy 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 15 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. 8 pl ligáit eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014; recaA-, hr-, h+, delta-trpES, thr, leu, thi, lacY-; Carbon-tól kaptuk: Dept, of Biological Sciences, University of California, Santa Barbara) törzset transzformálunk. A törzset az alábbi állandó törzsgyűjteményben helyeztük letétbe: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Az ampicillinre rezisztens transzformánsokból plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, az, egyikből izolált plazmid szerkezetét a 11. ábra 127-es helyén mutatjuk be, ezt a plazmidot pKEN030 sorszámmal jelöljük. A pKEN030 HindlII hasítási helyének eliminálására 2,5 pg pKEN030 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység HindlII restrikciós enzimmel kezelünk 50 pl HindlII pufferban, 1 órán át, 37°C hőmérsékleten. Fenol extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és a HindlII kohézív végeket 400 egység Sl-nukleázzal eltávolítjuk, 200 pl Sl-pufferban, 20°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakcióval. A dezoxi-ribonukleinsavat elkülönítjük és 0,75 pg-ját 33 18 újra körré zárjuk oly módon, hogy 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 10 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át tartó reakcióval. 3 pl ligációs eleggyel E. coli JA221 (NRRL B-15014) törzset transzformálunk, és az ampicillinre rezisztens transzformánsokból izolált egyik plazmid szerkezetét a 11. ábra 128 jellel jelölt helyén mutatjuk be. A plazmid HindlII hasítási helyet nem tartalmaz, és pKEN033 sorszámmal jelöljük. A 11. ábra 129 számmal jelölt helyén, és részletesebben, a 12. ábrán bemutatjuk, hogy a pKEN033 plazmid dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját az EcoRI és BamHI restrikciós helyek között elhelyezkedő HindlII hasítási hely előállítására módosítjuk. Ügy járunk el, hogy 5 pg pKEN033 plazmid dezoxiribonukleinsavat (dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciáját lásd a 12. ábra a. helyén) kezelünk 50pl BamHI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át. A reakcióelegyet a BamHI enzim inaktiválására 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd a linearizált dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 10 egység EcoRI enzimmel tovább hasítjuk 100 pl EcoRI pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át tartó reakció során (lásd a 12. ábra b. helyét). Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a kapott 3,6 pg-nyi mennyiségű dezoxi-ríbonukleinsavakat 3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-polímerázzal (Bethesda Research Laboratories) kezeljük, 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 50 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=8,0, 100 mmól kálium-klorid, 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ditio-treitol, literenként. (Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban polimeráz-puffernak nevezzük.) A reakcióelegyhez 0,1 mmól/1 dATP-t, dGTP-t, dCTP-t és dTTP-t adunk. A reakciót 45 percen át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. A reakció során a BamHI és az EcoRI kohézív végeket, ahogy azt a 12. ábra c. részén látjuk, feltöltjük. A dezoxi-ríbonukleinsavak izolálását követően 300 pikomól foszforilezett HindlII linkért adagolunk, majd tompa-végligációt végzünk 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 15 pl ligáz-pufferban, amelyhez 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át végezzük. Ezután 100 pl HindlII pufferral hígítjuk a reakcióelegyet, és 100 egység HindlII restrikciós enzimmel hasítunk. A reakcióelegyet 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, a feles linker molekulák eltávolítására, és HindlII kohézív végek előállítására (lásd 12. ábra, d. pont), ezeket később összekapcsoljuk; ezzel újra körré zárjuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat. A körré-zárást 0,8 pg dezoxi-ribonukleinsavval és 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 34 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
