197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 körrel jelölt kockával jelöljük, illetve a „b“ betűvel. A proliprotein szignál peptid szakaszát a diagonális vonalakkal és a „c“ betűvel jelzett satírozott szegmenssel adjuk meg. Az lpp gén struktárszakaszát a diagonális szegmenssel jelöljük, amit „d“ betűvel jelzünk, míg az „e“ betűvel jelölt szegmens a 3,-nem transzlatált szakaszt és a transzkripció terminációs helyét jelzi. Ezeket a jeleket és a satírozást felhasználjuk az lpp gén hasonló funkcionális fragmenseinek jelölésekor a 7—11., 15., 17—18., 21—23. és 26—29. ábrákon is. A 7. ábrán azt a stratégiát szemléltetjük, amellyel a pBR322 plazmidba beépítjük az lpp gén promoterét és 5’-nem transzlatált szakaszát hordozó fragmenst. A célra választott fragmens egy 462 bázispárból álló pKENl 11-ből származó Alul fragmens, ezt sematikusan szemléltetjük az 5. ábra 105A részén. Ez nemcsak a promoter-szekvenciát és az 5’-nem transzlatált szakaszt tartalmazza (—45-től a —1-ig és a -j-1 -tői a +39-ig terjedő rész, sorrendben), de tartalmazza az lpp gén teljes adenin-timin-gazdag szegmensét, amely a promoter szekvenciát előzi meg. Az lpp promoter szakaszt tartalmazó 462 bázispárból álló Alul fragmens pBR322-be való klónozására a pBR322 EcoRI ésHindlII hasítási helyek közé eső dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst először kihasítjuk, ahogy azt a 7. ábra 106 jellel jelölt részén szemléltetjük. Ügy járunk el, hogy 11 pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 11 egység Hindin restrikciós endonukleázzal kezelünk 200 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 10 mmól magnézium-klorid, 60 mmól nátrium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban HindlII-puffernek nevezzük). A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 1 órán át. Az emésztés teljessé-válása után fenolos extrakciót végzünk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el. A HindlII kohézív végek eltávolítására a dezoxi-ribonukleinsavat 1,5 pl SÍ nukleázzal [Miles Laboratories] kezeljük, 300 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 30 mmól nátrium-acetát, pH=4,25, 0,3 mól nátrium-klorid és 4 mmól cink-szulfát (literenként) (a továbbiakban ezt az elegyet Sl-puffernak nevezzük). A reakciót 1 órán át végezzük 20°C hőmérsékleten. Ezután a reakció leállítására 30 pl 500 mmólos trisz-hidrogén-kloridot (pH=8,0) és 30 pl 250 mmólos etilén-diamin-tetraecetsavat adagolunk, majd ezt követően fenollal extrahálunk. A fenol eltávolítására az elegyet éterrel extraháljuk, és az alábbi elegy-25 14 gyei szemben dializáljuk, 4°C hőmérsékleten, egy éjszakán át: 0,01 X SSC (SSC: 0,15 mól nátrium-klorid + 0,015 mól nátrium-citrát literenként) A dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el. Ezután 200 pikomól foszforilezett EcoRI linkért adagolunk, és az elegyet 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 12,5 pl 0,6 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 12,5°C hőmérsékleten végezzük 16 órán át. 30 egység EcoRI restrikciós enzim adagolásával kohézív végeket állítunk elő 75 pl EcoRI-pufferban. A reakciót 2 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására fenollal extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el. Az EcoRI kohézív végeket ligáljuk, és a plazmidot így újra körré zárjuk 0,3 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal 20 pl ligázpufferban, amelyhez 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot adunk. A ligálást 7 órán át 12,5°C hőmérsékleten végezzük. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav 0,5 pg-nyi alikvot mennyiségét használjuk az E. coli JE5519 törzs (NRRL B-15013, F_, aroD, man, argE, lac, gal, rpsL, gyrA, recAl) transzformálására. A törzset Hirota-tól kaptuk (National Institute of Genetics, Mashima, Japán). A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményben van letétbe helyezve: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Tíz ampicillin-rezisztens és tetraciklinre érzékeny transzformánst egy éjszakán át növesztünk 1 ml L-táptalajban, amelyhez 50 pg/ml ampicillint adtunk. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat 0,5 ml tenyészetekből izoláljuk a gyors, alkalikus-denaturációs módszerrel, amit Bimbóim és Doly írtak le [Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)]. A terméket restrikciós enzimmel térképezve analizáljuk. A plazmidok egyikének szerkezetét a 107 jellel jelzett helyen a 7. ábrán adjuk meg, ezt pKEN005 jellel jelöljük. A 7. ábra 108 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk azt, ahogy az lpp promotert tartalmazó 462 bázispár nagyságú Alul fragmenst kapjuk. Ügy járunk el, hogy 100 pg pKENl 11 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Mspl restrikciós enzimmel emésztünk 600 pl alábbi összetételű pufferban: 10 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 10 mmól magnézium-klorid, 6 mmól kálium-klorid, 1 mmól ditio-treitol literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban Hpal-puffernak nevezzük). A reakciót 37°C hőmérsékleten végezzük 3 órán át. (Bár a pKENl 11 több Mspl hasítási helyet tartalmaz, csak kettő, számunkra érdekest adtunk meg a 7. ábra 109 helyén.J A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket feno-26 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
