197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 los extrakciót követően 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 100 pl gél-pufferban oldjuk és 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. Ezután 6 pg tisztított, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmenst emésztünk Alul restrikciós endonukleázzal, 400 pl HindlII-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 2 órán át. Ily módon megkapjuk a 462 bázispárból álló Alul fragmenst, ezt gél-elektroforézissel tisztítjuk. 1 pg 462 bázispárból álló Alul fragmenst 150 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és az elegyhez 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt adunk, 10 pl, 0,6 mmól/ /I adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban. A reakciót 16 órán át végezzük 12,5°C hőmérsékleten. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavat 40 egység EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük 100 pl EcoRI-pufferban, 37°C hőmérsékleten, 1 órán át, amiután EcoRI kohézív végeket kapunk. Az emésztés leállítására az elegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, majd az elegyhez 0,6 pg EcoRI enzimmel emésztett pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk és fenollal extrahálunk. A dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el, és az EcoRI kohézív végeket 0,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk össze 20 pl, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavakkal E. coli JE5519 (NRRL B-15013) törzset transzformálunk, és a transzformánsokat L-táptalajon 12,5 pg/ml tetraciklin jelenlétében tetraciklin rezisztenciára szelektáljuk. A tetraciklinre rezisztens transzformánsok plazmid dezoxi-ribonukleinsavát gyors alkalikus-denaturációs módszerrel analizáljuk, izoláljuk. Az eredmények szerint a pKEN005 EcoRI helyére beépült a 462 bázispárból álló Alul fragmens. Ezt mutatjuk be a 7. ábra 110 helyén. Az így kapott plazmidot pKEN008 jellel jelöljük. 3) A pKENOlO plazmid előállítása Az A helyen beépített szakaszt tartalmazó lpp gént hordozó klónozó hordozók előállításának következő lépéseként a pKEN008 két EcoRI hasítási helye közül az egyiket elimináljuk. Ez azért szükséges, hogy biztosak legyünk abban, hogy csak egyetlen beépítési pont áll rendelkezésre a klónozásra kiválasztott külső eredetű gén számára, mégpedig jobbra haladva a 462 bázispárból álló Alul fragmenst közvetlenül követő helyen (ez most egy EcoRI fragmens), amely egyébként tartalmazza az lpp gén promotert és az 5’-nem transzlatált szakaszt. A 8. ábrán részletesen ábrázoljuk az lpp gén promoterétől távolabb eső EcoRI hely eltávolításának stratégiáját. Az alábbiak szerint járunk el: 4 pg EcoRI enzimmel emésztett pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat először SÍ nukleázzal keze’ll lünk az EcoRI kohézív végek eltávolítására, majd ezután BAP-val az önmagával való kapcsolódás meggátlására. Ahogy azt a 8. ábra 111 jellel jelzett részén sematikusan bemutatjuk, a dezoxi-ribonukleinsavakat ezután 0,76 pg tisztított, 462 bázispárból álló Alul fragmenssel keverjük (ez a 7. ábra kapcsán az előzőekben leírtak szerint a pKENl 11-ből származik), majd tompa-végligációt* végzünk 2,4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal, 10 pl, 0,6 mmól adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 16 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav felével E. coli JE5519 törzset (NRRL B-15013) transzformálunk, a transzformánsok egyike tartalmazza a 8. ábra 112 jellel jelölt részén ábrázolt szerkezetű plazmidot. Ezt a plazmidot pKEN002 jellel jelöljük. A pKEN002 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 25 pg-ját Pvul és Xbal restrikciós enzimekkel kezeljük, 500 pl alábbi összetételű pufferban: 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9, 6 mmól magnézium-klorid, 150 mmól nátrium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként, és 100 pg/ml borjú szérum albumin (az előző összetételű elegyet a következőkben BamHI-puffernak nevezzük). A reakciót 1 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük. A kapott 1,04 kb nagyságú Pvul-Xbal dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (lásd a 8. ábra 113 részét) gél-elektroforézissel tisztítjuk. A 8. ábra 114 helyén sematikusan szemléltetjük azt, hogy hogyan származik a 24 bázispárból álló Xbal-EcoRI dezoxi-ribonukleinsav-fragmens a pKEN008-ból. Ügy járunk el, hogy 25 pg pKEN008 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI restrikciós enzimmel emésztünk, és egy 470 bázispárból álló EcoRI-fragmenst gél-elektroforézissel tisztítunk. 1 pg, 470 bázispárból álló EcoRI-fragmenst ezután Xbal restrikciós enzimmel emésztünk, és 1 pg 1,04 kb nagyságú Pvul-Xbal dezoxi-ribonukleinsav-fragmenssel keverünk, amely utóbbit előzőleg állítottunk elő. Az elegyhez előzőleg Pvul és EcoRI restrikciós enzimmel emésztett 0,75 pg mennyiségű pKEN005 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk (lásd a 8. ábra 115 jellel jelölt helyét). A dezoxi-ribonukleinsav-elegyet 0,8 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük, 50 pl 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot tartalmazó ligáz-pufferban, 12,5°C hőmérsékleten, 7 órán át. A ligáit dezoxi-ribonukleinsav felével E. coli JE5519 törzset transzformálunk (NRRL B-15013), és a transzformánsokat tetraciklin rezisztenciára szelektáljuk. A 0,5ml tetraciklin-rezisztens transzformánsokból készült tenyészetből gyors alkalikus-denaturációs módszerrel plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat izolálunk, ezek analízise szerint az egyik plazmid a 8. ábra 116 helyén megadott szerkezetű. Ezt a plazmidot pKENOlO jellel jelöljük. 28 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
