197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 térben szárítjuk. így 10 pg tiszta, 2,8 kb nagyságú HaelII fragmenshez jutunk. A 2,8 kb nagyságú HpelII fragmens pSCIOl plazmidba való klónozására EcoRI linker molekulákat kötünk a 2,8 kb nagyságú HaelII fragmens végeire (lásd a 6. ábra 103 jellel jelölt részét). Az EcoRI linkereket (5’-GGAATTCC3’; Collaborative Research) T4 polinukleotid-kinázzal foszforilezzük (a kináz a Biochemicals P.L. terméke) ATP jelenlétében, az alábbi összetételű rakcióelegyben: 50 pl a rakcióelegy össztérfogata; tartalmaz: 3 mól linkért, 66 mmól trisz-hidrogén-kloridot, pH=7,5, 10 mmól magnézium-kloridot, 10 mmól ß-merkapto-etanolt, 60 pmól ATP-t literenként, és 10 egység T4 polinukleotid-kinázt. 30 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk, és ezután 37°C-ra hűtjük, 0,1 mól/1 ß-merkapto-etanol 5 pl-ét és 10 egység T4 polinukleotid-kinázt adunk az elegyhez, és további 30 percen át folytatjuk az inkubálást 37°C hőmérsékleten. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet szárazjég-etanol fürdőben lefagyasztjuk. 2 pg 2,8 kb nagyságú HalII fragmenst 150 pikomól foszforilezett EcoRI linkerrel keverünk, és az elegyet 4 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kezeljük 12,5 pl alábbi összetételű reakcióelegybeti: 66 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 10 mmól magnézium-klorid, 10 mmól ditio-treitol (ezt a reakcióelegyet a továbbiakban ligáz-pufferként említjük), és 0,6 mmól ATP literenként. A reakciót 15 órán át 12,5°C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására az elegyet 20-szorosra hígítjuk EcoRI pufferral és 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. 30 egység EcoRI restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez, és 1 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk EcoRI kohézív végek előállítására. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percen át 60°C hőmérsékleten tartjuk. Á kapott elegyhez 2 pg előzőleg linearizált pSCIOl dezoxi-ribonukleinsavat adunk, és fenollal extrahálunk. Éteres extrakciót követően etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavakat, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 100 pl ligáz-pufferban oldjuk. Az elegyet 5 percen át 37°C hőmérsékleten tartjuk, és az EcoRI kohézív végeket 4°C hőmérsékleten 16 órán át, és ezután 1 órán át 0°C hőmérsékleten hasítjuk. Ezután 0,4 mmól végkoncentrációig adenozin-trifoszfátot adagolunk, majd 1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt és az elegyet 12,5°C hőmérsékleten inkubáljuk, 7 órán át. A ligációs elegy negyedrészével E. coli lpp deléciós mutáns törzset transzformálunk 23 [JE5527, NRRL B-15012; F“, man, lpp-2, pps, thi, his, rpsL, gyrA, recAl; Hirota és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 1417— 1420 (1977)]. A törzset Hirota-tól kaptuk, National Institute of Genetics, Mashima.Japán A törzs az alábbi állandó törzsgyűjteményből beszerezhető: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A transzformációt Cohen és munkatársai szerint végeztük [Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69, 2110-2114(1972)]. A tetraciklinre rezisztens transzformánsokat egy éjszakán át olyan Whatman 3MM szűrőpapíron növesztettük, amelyeket 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-táptalajra helyeztük. Az lpp kiónokat telephibridizációval választjuk ki [Gergen és munkatársai, Nucleic Acids Res., 7, 2115-2136 (1979)]. Az lpp gént tartalmazó, 0,95 kb nagyságú Mspl fragmenst elválasztjuk a lambda lppEc-l-ből, és a nick-transzlatáljuk (a-32P] dATP-vel és [a-P32] dCTP-vel Maniatis és munkatársai szerint eljárva (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 72, 1184—1188 (1975)]. Ezt használjuk R32- -próbaként. Egy pozitív hibridizációt mutató transzformáns tartalmazza azt a plazmidot, amelynek a szerkezetét a 6. ábra 104 jellel jelölt részén mutatjuk be. Ezt a plazmidot pKENI 11 jellel jelöljük. A plazmid az E. coli CC620/pKEN 111 törzsből (NRRL B-15011) nyerhető, ez az alábbi állandó törzsgyűjteményben található meg: Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. A plazmidot az NRRL B-15011 sejtekből ismert módon izolálhatjuk. 2) A pKEN008 plazmid előállítása Az lpp gént kifejező találmány szerinti plazmidok előállításához használt szülői plazmid a pBR322. Ennek molekulasúlya 2,6 megadelton. A plazmid ampicillinre (Amp) és tetraciklinre (Te) rezisztenciát biztosító géneket hordoz [Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95—113 (1977)]. Ahogy azt a 7. ábrán látjuk, a pBR322 a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén 5’-végén egy EcoRI hasítási helyet tartalmaz, ugyanakkor a tetraciklin rezisztencia gén promoterén belül egy HindlII hasítási helyet, és az ampicillin rezisztencia génen belül pedig egy Pvul hasítási hely található. A pBR322 plazmidot Arnheim-től kaptuk [Department of Biochemistry, State University of New York, Stony Brook], A plazmid a Bethesda Research Laboratoriestől vásárolható meg. Az 5. ábrán sematikusan szemléltetjük az lpp gén különböző komponenseit, mindegyiket jelekkel vagy satírozással jelöljük. A besötétített szegmensek, amelyeket „a“ betűvel jelölünk, adeninben és timinben gazdag szakaszt reprezentálnak, ez 260 bázispárból áll, és megelőzi a transzkripció kezdetét meghatározó helyet, továbbá tartalmazza az lpp promotert. Az 5’-nem transzlatált szakaszt a 24 13 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
