197937. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plipeptidek mikrobiológiai gazdasejtekben való kifejezésére használható új klónozó hordozók előállítására
197937 ugyanakkor az SÍ nukleázt a Miles Laboratories-től kaptuk. A) Az A-típusú plazmidok (pIN-I) előállítása A 6—15. ábrákon sematikusan szemléltetjük azoknak a rekombináns plazmidoknak az előállítását, amelyekben az A beépítési helyet töltjük fel, és az alábbiakban ismertetjük a részletes eljárást. 1) A pKENI 11 plazmid előállítása Az A típusú lpp gén klónozó hordozók előállításának első lépéseként egy olyan plazmidot állítunk elő, amely az lpp gén komponenseinek forrásaként szolgál az eljárás további lépései során. Az E. coli lpp gént felvevő plazmidként a pSCIOl plazmidot választjuk (molekulatömege 5,8 megadelton), a plazmid a tetraciklinnel szembeni rezisztenciát meghatározó gént tartalmazza [Cohen és munkatársai, J. Bacteriol., 132, 734—737 (1977)]. A 6. ábrán láthatjuk, hogy a pSCIOl tartalmaz a tetraciklin rezisztenciát meghatározó gén 5’-végén egy EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítható helyet. A pSCIOl plazmidot Ohtsubo-tól kaptuk (Department of Microbiology, State University of New York, Stony Brock). A 6. ábra 101 jellel jelölt részén sematikusan ábrázoljuk az eljárást, amely szerint 2 pg pSCIOl dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk 5 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 100 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 75 mmól nátrium-klorid, 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként és 100pg/ml borjú szérum albumin. A reakcióelegyet a továbbiakban EcoRI pufferként jelöljük. A reakció 37°C hőmérsékleten végezzük, 60 percen át. Az EcoRI enzimmel kezelt pSCIOl dezoxi-ribonukleinsav önmagával való összekapcsolódásának gátlására alkalikus foszfatázt adagolunk (0,1 egység Worthington BAPF) és az inkubálást 60 percen át folytatjuk, 37°C hőmérsékleten. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le, és a linearizált dezoxi-ribonukleinsavakat etanolos kicsapással különítjük el. A 6. ábra 102 jellel jelölt része szerint eljárva, az E. coli lpp gént tartalmazó 2,8 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst állítunk elő az E. coli lpp gént (lambda lppEc-1 jellel jelöljük) hibrid lambda tágból. Az lpp gént előzőleg egy lambda fág vektorba klónozták, ez a lambda 540 [Murray és Murray, J. Mol. Biol., 98, 551—564 (1975)]. Az alábbiak szerint járunk el: 200 pg teljes dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk az lpp gén szempontjából merodiploid E. coli K12 törzsből [JE5519/F506, Movva és munkatársai, J. Bacteriol., 133, 81—84 (1978)]. A dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység HindlII restrikciós enzimmel kezeljük. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket preparatív agaróz gélen sze-21 12 páráijuk, és a 10 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Ezek a fragmensek a Southern-hibridizációs technikával pozitív hibridizációt mutatnak az 5’-p32-lipoprotein mRNS molekulákkal [J. Mól. Bioi., 98, 503— 517]. A körülbelül 20-szorosra töményített, 10 kb nagyságú HindlII fragmenseket tartalmazó elegyet és a HindlII enzimmel hasított lambda540 vektor dezoxi-ribonukleinsavat T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal reagáltatjuk. A ligáit dezoxi-ribonukleinsavval E. coli K802 sejteket fertőzünk (NRRL B-15016, Blattner-től kaptuk, Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison). Ezt a törzset letétbe helyeztük az alábbi állandó törzsgyűjteményben: Northern Regional Research Laboratory, US. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA. Olyan lpp gént hordozó rekombináns fágot keresünk, amelyet Benton és Davis hibridizációs technikájával ki tudunk mutatni [Science, 196, 180— 182 (1977)]. A kísérlet során 5’-P32-lipoprotein mRNS-t használunk. Egy pozitív hibridizációt adó plakkot találtunk; ez a teljes funkcionális lpp gént hordozza, a fágot lambda lppEc-1 jellel jelöljük. 200 pg lambda lppEc-1 dezoxi-ribonukleinsavat 200 egység HaelII restrikciós enzimmel teljesen emésztünk 500 pl alábbi összetételű reakcióelegyben: 6 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, 6 mmól magnézium-klorid, 6 mmól nátrium-klorid, 6 mmól ß-merkapto-etanol literenként és 100pg/ml borjú szériumalbumin. Ezt a reakcióelegyet a továbbiakban HaelII puffernak nevezzük. A reakciót 2 órán át 37°C hőmérsékleten végezzük, és a 2,8 kb nagyságú, az E. coli lpp gént hordozó HaelII fragmenst 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionálva tisztítjuk, az alábbiak szerint: a rakcióelegyet először fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket 2,5 térfogatnyi etanollal kicsapjuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, 200 pl alábbi összetételű pufferban végül oldjuk: 5% glicerin, 20 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsav, 0,05% bróm-fenol kék és 0,05% xilol-cianol (ezt az elegyet a továbbiakban gél-puffernak nevezzük). Ezután végezzük az 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen való frakcionálást. A 2,8 kb-nak megfelelő távolságra elmozdult dezoxi-ribonukleinsav-csíkot kivágjuk a gélből, és a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket elektroforézissel eluáljuk. A dezoxi-ribonukleinsav gélen való elhelyezkedésének megfigyelésére használt etidium-bromid festéket fenolos extrakcióval távolítjuk el a dezoxi-ribonukleinsav fragmensekről. 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket, centrifugáljuk, 200 pl 0,3 mólos nátrium-acetát-oldatban oldjuk, 0,5 ml etanollal újra kicsapjuk, és csökkentett nyomású 22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
