197930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alacsony viszkozitású, nagy molekulájú, szűréssel sterilizálható hialuronsav előállítására
197930 lombikba pipettálunk. A mozgó fázissal jelig töltjük. A kapott oldat 1000 pg/ml kék dextránt tartalmaz. A két törzsoldat hűtés közben 30 napon keresztül tárolható. A munkaoldatokat a törzsoldatokból naponta frissen készítjük. A két munkaoldatot kromatografálás előtt 0,22 pm-es szűrőn szűrjük. 4.2. d Az standard oldatokból 3,5 ml-t a megfelelően megjelölt vizsgálati csövekbe mérünk. A vezérlőberendezésen beállítjuk a befecskendezések számát. 4.2. e A két standardnál meghatározzuk az elúció közepes átlagtérfogatát (Ve). 4.2. f Mindkét standardnál Km értéket számolunk az alábbi képlet szerint: Ve-VB K,v =------------V,-V0 a képletben Vc = elúciós térfogat, V0 = üres térfogat (teljes kizárás a gélpórusokból) V0= (Vr0,33), V; = a töltött gél ossz oszloptérfogata Kou = a stacionális géltérfogat tört része, amely az oldott faj diffúziójához minden esetben rendelkezésre áll. Vf = nr2h, r = az oszlop belső dimenziójának rádiusza, h = az oszlop töltetmagassága. 4.2. g A grafikus ábrázoláshoz az X tengelyre a standard log Ma, értékét, az Y tengelyre a Kot- értékre visszük fel. A diagramban felvisszük a standardok Kod értékét és berajzoljuk mindkét standard pontot metsző kiegyenlítő görbét, vagy a fenti adatokat lineáris regresszióra programozott számítógépbe vagy komputerbe visszük be. 4.3 A minta átlagos móltömegének meghatározása 4.3. a 0,80—1,2% HA-t tartalmazó mintából 0,48—0,52 grammot 20 ml mérőlombikba mérünk. A mozgó fázissal jelig töltjük (hígítás 1:40). 4.3. b Ha a minta HA-tartalma 0,80% alatt van, 0,78—0,82 grammot mérünk 20 ml mérőhengerbe. A mozgó fázissal jelig töltjük. (Hígítás 1:25). 4.3. C Ha a minta 1,2—2,0% HA-t tartalmaz, 0,31—0,35 grammot 20 ml mérőlombikba mérünk. A mozgó fázissal jelig töltjük (hígítás 1:60). 4.3. d A fent megadott munkamódszert követve a 0,7 pm-en átszűrt mintából 1000 pl-t fecskendezünk be a standard meghatározásakor alkalmazott körülmények között. 4.3. e Minden befecskendezésnél meghatározzuk a Ve értékét és kiszámítjuk a KTMértékét. 4.3. f A minta KTMértékéből grafikusan.vagy számítógép segítségével meghatározzuk az lg M«, értékét. A logaritmus visszaszámolásával kiszámítjuk az átlagos móltömeget. 5 5.0 Az eredmények érvényessége 5.1 Standard A standard értékek érvényesek, ha a tireoglobulin Ve értékei 1,25—1,39 ml/cm gél közé esnek. A kék dextrán első csúcsának Vt értéke 0,82— 0,90 ml/cm gél (a második csúcs 2.000.000 alatti móltömegü frakcióhoz tartozik). 5.2 Minta Az eredmények érvényesek, ha a minta Ve értékei a standard görbére esnek. 5.3 Az eredmények érvényesek, ha a standard vagy minta Ka« értékei 0,0 és 1,0 közé esnek. 5.4 Az eredmények érvényesek, ha a minta koncentrációja 0,20—0,30 mg/ml közé esik (vagy eltolódás lehetséges). 6.0 Megjegyzés A standard görbét 30 naponként ismét fel kell venni, kivéve, ha a paraméterek változása, például a gél besűrűsödése vagy új oszlop alkalmazása nem teszi szükségessé a korábbi felvételt. A PBS-P mozgó fázis összetétele: 0,5 g nátríum-kloridot, 0,223 g dinátrium-hidrogén-foszfátot (vízmentes) és 0,04 g nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrátot 1000 ml -es mérőlombikban ionmentesített vízzel jelig töltünk. A vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfát helyett alkalmazhatunk 0,28 g dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot is. Az elegyet jól elkeverjük, majd felhasználás előtt 0,22 pm-es szűrőn szűrjük. Az elegy steril körülmények között 15 napon keresztül szobahőmérsékleten tárolható. Az 1. táblázatban szereplő elegyeket nyitott edényben 7—20 napon keresztül mintegy 60°C konstans hőmérsékleten melegítettük. A kezelés hatására a viszkozitás jelentősen (például az 1. számú elegynél 4,475x xl0~3-ról 1,34-10 _4-re) csökken, míg a móltömeg állandó marad. A 2. ábra a 2. számú elegy alikvot részének FPLC csúcsát mutatja, amelyet a hőkezelés során vettünk fel. Az összes csúcs azonos, ami arra utal, hogy a móltömeg hő hatására a legkisebb mértékben sem változik. A 2. táblázatban szereplő adatokat 1 tömeg%-°s nátrium-hialuronát (NaH) oldat három alikvot részének azonos ideig 30—50°C közötti hőmérsékleten történő hőkezelésével vettünk fel. Nyilvánvaló, hogy az ilyen polimer oldat viszkozitása hosszú tárolás alatt már 30°C hőmérsékleten csökken (3,18-10-4- -ről 2,98* 10-4-re). Ha a hőmérsékletet 50°C értékre emeljük, azonos időtartamon belül nagyobb viszkozitás-csökkenést (vagyis 3,18x xl0-4-ról 1,75- 10_4-re) kapunk. A móltömeg nem változik. A magas hőmérséklet hatását az NaH viszkozitására a 3. táblázat mutatja. 1,1 tömeg% NaH oldatot 30 percen keresztül autoklávban (1,034 bar nyomás és 121°C hőmérséklet) hőkezeltük. Ezután ismét autoklávoztuk. A 3. táblázat szerint a rövid idejű, magas hőmérsékletű hőkezelés a móltömeg megváltozása nélkül jelentősen befolyásolja a viszkozitást. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 35 4
